Для понимания закономерностей регулирования селективности ЖХ разделений нам придется вернуться к самым истокам – к определению хроматографии. В первой главе был введен термин, но не дано строгое определение – по той причине, что в нем содержится информация, несколько избыточная для начального уровня.
Итак, хроматография – это процесс разделения веществ:
- в двухфазной системе;
- фазы должны перемещаться относительно друг друга (чаще подвижной является только одна фаза, а другая остается неподвижной).
Следует сразу отметить, что определение хроматографии не дает никаких указаний относительно того, что подразумевается под "фазой", и на каких принципах основано перераспределение вещества между фазами. В результате, "хроматографией" можно называть любые процессы, удовлетворяющие формальному определению; при этом, природа этих процессов может быть совершенно различной.
В современной ВЭЖХ можно выделить несколько типов жидкостной хроматографии, которые различаются по принципам разделения веществ. Особый интерес, однако, представляют всего два типа ЖХ, которые наиболее часто применяют на практике: эксклюзионная хроматография и адсорбционная хроматография.
Эксклюзионная хроматография основана на эксклюзии, то есть исключении, молекул определенного эффективного диаметра из пор с меньшим диаметром. В результате крупные молекулы проходят меньший путь внутри пор, и элюируются раньше мелких. Неподвижной фазой в этом случае является неподвижный элюент внутри пор, а подвижной – элюент, движущийся между частицами носителя. Никакого взаимодействия между твердым носителем и разделяемыми веществами не происходит.
Напротив, адсорбционная хроматография основана на адсорбции, то есть взаимодействии твердого носителя (адсорбента) и разделяемых веществ. Вещества с меньшим суммарным взаимодействием проводят меньше времени в неподвижном, адсорбированном состоянии, и поэтому элюируются быстрее. Вещества с большим суммарным взаимодействием, по аналогии, элюируются позднее.
Удерживание в жидкостной хроматографии определяется не только взаимодействием "адсорбент-вещество", которое его увеличивает, но также взаимодействием "элюент-вещество", которое его уменьшает, и взаимодействием "адсорбент-элюент" (динамическое модифицирование), которое может изменять его в любую сторону.
Возможность существования различных комбинаций типов взаимодействий между адсорбентом, элюентом и веществом обуславливает значительное разнообразие вариантов проведения адсорбционной ЖХ. Будем рассматривать каждый такой вариант как отдельный адсорбционный режим хроматографирования. Введем еще один термин: все адсорбционные режимы, плюс эксклюзионный режим, плюс все остальные возможные будем в общем называть хроматографическими режимами (liquid chromatographic mode, LC mode).
В то время как эксклюзионный режим один, адсорбционных режимов может быть по крайней мере несколько. Каждый адсорбционный режим логически связан с тем или иным физико-химическим свойством адсорбата (адсорбируемого вещества), или же с целым комплексом свойств, интуитивно воспринимаемых как одно. Перечислим основные из них.
Полярность-неполярность. Для апротонных веществ полярность соединения можно соотнести с дипольным моментом молекулы. Дипольный момент характеризует суммарную величину несимметричности распределения электронной плотности в молекуле. В результате, даже электронейтральная молекула, обладающая асимметрично распределенной электронной плотностью (постоянным дипольным моментом), может вступать в электростатические взаимодействия.
Для протонных веществ важной характеристикой, связанной с полярностью, является способность образовывать водородные связи. Сила водородной связи зависит от окружения молекулы, поэтому вклад водородных связей в величину полярности зависит от строения ассоциатов соединения с компонентами растворителя.
Гидрофобность-гидрофильность. Гидрофобность соединения привязана к его константе распределения в двухфазной системе, одной из которых является вода, а другой – несмешивающийся с ней органический растворитель. Как правило, измерения константы распределения проводят в системе "октанол-вода". Чем большая равновестная доля вещества содержится в октаноле, тем более оно гидрофобно и тем менеее гидрофильно. По аналогии, чем большая равновестная доля вещества содержится в воде, тем более оно гидрофильно и менее гидрофобно.
Существует тенденция, согласно которой полярные вещества в целом более гидрофильны, а неполярные – более гидрофобны. Однако, это закономерность не будет работать, к примеру, в ряду метильных гомологов. При введении в молекулу дополнительных метильных групп ее полярность не изменится, а гидрофобность будет увеличиваться на равную величину.
Свойство гидрофобности удобно тем, что его можно оценить по структурной формуле соединения – что крайне непросто сделать для полярности. Существуют даже аддивные формулы для рассчета гидрофобности, которые основаны на знании инкрементов (вкладов) различных функциональных групп в суммарную гидрофобность соединения.
Электрический заряд. Для органических ионов и ионизируемых соединений (кислот и оснований) одним из наиболее важных свойств является суммарный электрический заряд. Для ионизируемых соединений, которые могут существовать в различных формах с разным зарядом, величина суммарного электрического заряда зависит от соотношения концентраций этих форм. В водных средах соотношение концентраций различных форм зависит от рН среды: в кислой среде суммарный положительный заряд оснований возрастает, а суммарный отрицательный заряд кислот уменьшается; в щелочной среде суммарный положительный заряд оснований уменьшается, а суммарный отрицательный заряд кислот возрастает.
Ненасыщенность-насыщенность. Для органических соединений важной отличительной особенностью структуры является наличие ненасыщенных π-электронных фрагментов: кратных связей (С=С, С≡С, С=О, С=N) и ароматических систем. Такие соединения могут образовывать комплексы с переносом заряда как с подобными им соединениями (π-π комплексы), так и с переходными металлами (π-d комплексы), а также с их ионами, соединениями, комплексами и т.д.
Хелатирующие свойства. Органические соединения, содержащие N- и O-локализованные неподеленные электронные пары в подходящей конфигурации, склонны к проявлению хелатирующих свойств, т.е. образуют комплексы со многими металлами. Природа хелатирования – образование комплексов с переносом заряда n-d типа.
Далее свяжем каждое из перечисленных свойств с тем или иным адсорбционным хроматографическим режимом:
1. режим, связанный со свойством "полярности-неполярности", будем называть нормально-фазовым режимом;
2. режим, связанный со свойством "гидрофобности-гидрофильности", будем называть обращенно-фазовым режимом;
3. режим, связанный с величиной электрического заряда, будем называть ионным режимом;
4. режим, связанный со свойством "ненасыщенности-насыщенности", а также с хелатирующими свойствами, будем называть режимом с переносом заряда. При необходимости будем дополнительно пояснять, о комплексах какого типа (π-π, π-d, n-d) идет речь.
Таким образом, все многообразие адсорбционных режимов сведем всего к четырем: нормально-фазовому (normal-phase, NP), обращенно-фазовому (reversed-phase, RP), ионному (ion chromatography, IC) и с переносом заряда (charge transfer, CT).
Для каждого адсорбционного режима можно составить список применяемых растворителей или их смесей, расположив их в ряд по возрастанию элюирующей силы. Такой ряд называется элюотропным. То же самое, в принципе, можно проделать и с неподвижными фазами,расположив их в порядке большего проявления удерживания в выбранном режиме.
Таким образом, не исключены случаи, когда механизм удерживания на данной неподвижной фазе будет обусловлен не одним режимом, а сочетанием нескольких режимов. Более того, величина вклада того или иного режима в подобных случаях будет определяться как составом элюента, так и природой адсорбата (целевого вещества). Сочетания нескольких хроматографических режимов называют смешанными режимами (mixed mode). Название смешанного режима образуется простым совмещением аббревиатур составляющих режимов через слэш, например: SE/RP (эксклюзионный/обращенно-фазовый), NP/IC (нормально-фазовый/ионный), RP/CT (обращенно-фазовый/с переносом заряда) и т.д.
В противоположность смешанным режимам, варианты ЖХ с явным доминированием одного определенного режима будем называть видом хроматографии. Минорные режимы, которые в этом случае привносят лишь небольшие вариации в одну генеральную селективность разделения, будем называть дополнительными режимами (см. табл. 10).
Таблица 10. Виды жидкостной хроматографии
2.2.2. Физическая и химическая структура неподвижных фаз для ВЭЖХ
По своей физической структуре неподвижные фазы для жидкостной хроматографии могут представлять собой частицы и монолиты различной степени пористости. На данный момент основными типами адсорбентов с различной физической структурой являются: пористые частицы, поверхностно-пористые частицы, непористые частицы и пористые монолиты.
Большинство неподвижных фаз построено на основе пористых частиц. Природа пористого материала основы может быть как неорганической (силикагель, окись циркония, окись титана и др.), так и органической (полистирол-дивинилбензол, полиметакрилат и др.). Полимерные материалы менее популярны из-за меньшей эффективности и большей цены. Силикагельные адсорбенты продолжают оставаться наиболее дешевыми, универсальными и востребованными.
В настоящий момент выпускают силикагельные частицы различного среднего диаметра, для аналитических приложений – от 5 мкм до 1.5 мкм. Эволюция пористых частиц в направлении уменьшения радуса связана с тем, что на частицах меньшего размера диффузнный путь адсорбата также сокращается, что приводит к росту эффективности разделения. Наиболее серьезным ограничением применения частиц малого размера связано с квадратичным ростом давления при уменьшении диаметра частиц.
Широким кругом пользователей освоены частицы диаметра от 2 до 5 мкм. Суб-2-х мкм частицы пока не столь популярны; их внедрение органичено целым рядом факторов, от необходимости применения более дорогих насосных систем свехвысокого давления до сравнительно невысокой гидролитической стабильности. Однако, не исключено, что при прогрессе технологии синтеза подобных адсорбентов их популярность вскоре возрастет.
Реальную конкуренцию пористым частицам в ближайшее время могут составить поверхностно-пористые частицы, т.е. частицы с пористой внешней оболочкой и непористым ядром. Смысл их применения состоит в меньшем диффузном пути адсорбата (и большей эффективности разделения) при не слишком малом диаметре самих частиц. Таким образом, по сравнению с полностью пористыми частицами заданная удельная эффективность достигается на частицах большего размера, т.е. при меньшем давлении в системе – что и составляет главное преимущество поверхностно-пористых адсорбентов.
Основное препятствие на пути их широкого внедрения, по-видимому, заключается в том, что технология синтеза подобных адсорбентов сложна, и ее тщательная отработка требует времени. Хотя в настоящий момент на рынке и существуют несколько марок адсорбентов подобного типа, их преимущество над традиционными пористыми частицами пока не столь очевидно. В идеале, поверхностно-пористые частицы должны обладать весьма значительным диаметром, например, порядка 10 мкм (сейчас около 3 мкм), а их пористый слой должен иметь толщину порядка микрона и менее (сейчас – около 1 мкм для 3 мкм частиц).
Среди пористых монолитов наиболее широкую известность приобрел пористый монолитный силикагель. Это адсорбент также внедрялся как аналог пористых частиц силикагеля, но в результате так и не смог значительно потеснить их с рынка неподвижных фаз. Монолитный адсорбент полностью заполняет хроматографическую колонку. Ажурная архитектура монолитного силикагеля обеспечивает хорошую гидродинамику колонки; давление на колонках с монолитным силикагелем примерно соответствует таковому для колонок, заполненных 4 мкм частицами.
Непористые частицы применяются достаточно ограниченно, в основном при синтезе адсорбентов низкой емкости для ионной хроматографии. Крупнопористые частицы широко применяются в эксклюзионной хроматографии.
Важной характеристикой пористого адсорбента является удельная площадь поверхности, которую измеряют в м2/г. Удерживание в любом адсорбционном режиме тем выше, чем выше удельная площадь поверхности. Что так же важно – от этой характистики адсорбента напрямую зависит его емкость и, соответственно, максимально возможная нагрузка.
Удельная площадь поверхности сильно связана с общей пористостью адсорбента – долей объема пор относительного всего объема адсорбента – и с распределением пор по размеру, в частности, со средним диаметром пор. Чем крупнее поры, тем меньше их удельная поверхность. К примеру, поры диаметра порядка 120-60 ангстрем ("классические" поры) имеют удельную поверхность порядка 200-600 м2/г, а поры диаметра 1000-2000 ангстрем (транспортные поры, или макропоры) – в лучшем случае несколько десятков м2/г.
Современные силикагели для адсорбционной хроматографии имеют средний диаметр пор порядка 100-120 ангстрем при удельной поверхности 200-300 м2/г. Эти характеристики обеспечивают оптимальный баланс между проницаемостью адсорбента для сравнительно небольших молекул и адсорбционной емкостью. Для разделения более крупных молекул (например, полипептидов, белков) в адсорбционных режимах производят адсорбенты с порами большего диаметра, порядка 200-300 ангстрем.
Химическая структура адсорбента зависит как от его природы, так и от технологии синтеза. Многие виды адсорбентов получают в результате химического взаимодействия некоторых химических реагентов с другими адсорбентами – адсорбентами-основами. В этом случае процесс химического изменения поверхности адсорбента называют химическим модифицированием, а прививаемый к адсорбенту-основе химический реагент – модифицирующим реагентом.
Среди неорганических адсорбентов-основ наибольшей популярностью обладает силикагель; доля остальных неорганических материалов (например, окиси циркония) для изготовления модифицированных адсорбентов очень невелика. Среди органических полимерных адсорбентов-основ наибольшей популярностью обладают полистирол-дивинилбензолы (на их основе получают большинство фаз для ионной хроматографии), несколько меньшей – метилакрилаты.
Немодифицированные адсорбенты-основы могут непосредственно применяться как неподвижные фазы. Например, силикагель напрямую применяют для проведения разделений в нормально-фазовой и гидрофильной хроматографии. Нейтральный полистирол-дивинилбензол ограниченно применяют в обращенно-фазовой и более широко – в эксклюзионной хроматографии.
Однако, даже самые лучшие адсорбенты-основы не могут быть достаточно универсальными и обеспечивать всего спектра необходимых свойств. Поэтому большинство типов современных адсорбентов получают путем химического модифицирования адсорбентов-основ. Существует несколько способов химического модифицирования, выбор которых во многом определяется химической природой адсорбента-основы.
Большинство неподвижных фаз на основе силикагеля получают в результате реакции силикагеля с замещенными хлорсиланами по схеме:
Адсорбент-Si-OH + Cl-Si(CH3)2-R = Адсорбент-Si-O-Si(CH3)2-R,
где R – заместитель. Реагент прививается на силанольную гидрокси-группу, т.е. в результате реакции образуется химическая связь между кислородом силикагеля и кремнием реагента.
Широко распространены обращенные фазы, в которых R = C18H37 (марка С18), или C8H17 (марка С8). Для полярных фаз на основе силикагеля R = (CH2)3-NH2 (аминофаза), (CH2)3-CN (нитрильная фаза).
Новую фазу можно создать, модифицируя уже привитую фазу; к примеру, целый спектр амидных фаз с различными свойствами (наиболее расространенной является С16-амидная фаза) можно получить из аминофазы по реакции ацилирования:
Адсорбент-Si-O-Si(CH3)2(CH2)3-NH2 + Cl-C(O)R = Адсорбент-Si-O-Si(CH3)2(CH2)3-NH-C(O)R.
Ввести новые функциональные группы можно и в полимерный адсорбционный материал. Такие реакции в химии высокомолекулярных соединений называют полимер-аналогичными превращениями.
Так, полимерные материалы на основе полистирола могут сульфироваться с образованием сульфокатионита. Они также могут хлорметилироваться; реакция хлорметилированного полимера с аммиаком приводит к образованию аминофазы на полимерной основе. На основе аминофазы, как было показано, можно получить большое разнообразие иных неподвижных фаз. Существуют и другие методы введения функциональных групп в полимерные материалы, основанные, например, на реакции Фриделя-Крафтса.
Исходная основа может быть покрыта полимерным слоем (polymer-grafted film) с принципиально новыми адсорбционными свойствами. Для этой цели применяют основы с функциональными группами, способными вступать в реакцию полимеризации. Как правило, для этих целей применяют полимерные основы, приготовленные на базе дивинилбензола – поскольку они имеют достаточно много остаточных двойных связей.
Покрыть полимерной пленкой можно и неорганические адсорбенты-основы. Активные функциональные группы, способные инициировать полимеризацию, можно ввести по реакции:
Адсорбент-OH + Cl-Si(CH3)2-CH=CH2 = Адсорбент-О-Si(CH3)2-CH=CH2.
После получения материала с нанесенной полимерной пленкой в реакционную смесь добавляется соединение, сшивающее полимерные цепи.
Непористые и макропористые адсорбенты-основы с заряженными группами на поверхности могут быть обработаны суспензией коллоидных частиц противоположно заряженного полимерного материала. В этом случае полимерная пленка (electrostatic-agglomerated film) удерживается на поверхности основы за счет сильных электростатических взаимодействий. Заряд частиц совпадает с зарядом полимерной пленки. Материалы, приготовленные по приведенной технологии, называют пелликулярными (pellicular). Некоторые современные ионообменные фазы принадлежат к этому типу материалов.
2.2.3. Обращенно-фазовая хроматография (ОФ ВЭЖХ). Неподвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ
Типичная обращенно-фазовая хроматографическая система состоит из неполярной неподвижной фазы (НФ) и полярной подвижной фазы (ПФ). В качестве ПФ в обращенно-фазовой хроматографии применяются системы, состоящие из воды или водного буферного раствора, основы, и смешивающегося с водой органического растворителя, неполярной добавки. Элюирующая сила ПФ возрастает с увеличением доли органического растворителя.
Элюирующая сила неполярной добавки увеличивается в ряду: метанол < ацетонитрил, этанол < ТГФ < 2-пропанол < ацетон < хлористый метилен, хлороформ. Ацетонитрил и метанол применяются чаще всего, ТГФ и длинноцепочечные спирты – значительно реже, а хлороорганические растворители – в исключительных случаях. Достаточно адекватный элюотропный ряд εº(С18) для ОФ ВЭЖХ приведен в таблице 11.
Таблица 11. Элюотропный ряд εº(С18) для обращенно-фазовой хроматографии
Способность адсорбата к удерживанию в обращенно-фазовом режиме можно оценить при помощи удобной эмпирической характеристики, которая называется гидрофобностью. Чем выше гидрофобность соединения, тем лучше оно удерживается в ОФ системах, поскольку сильнее взаимодействует с неполярным адсорбентом, чем с полярным элюентом.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение двух изомерных соединений в обращено-фазовых условиях. НФ: С18 фаза. ПФ: ацетонитрил-водный буфер 60:40. www.chromforum.ru
Рисунок 90. Разделение двух изомерных соединений в обращено-фазовых условиях. НФ: С18 фаза. ПФ: ацетонитрил-водный буфер 60:40. Водный буфер: 0.5 мл триэтиламина на 100 мл воды, рН 2.8 фосфорной кислотой. В соединении, которое элюируется вторым, неполярные группы расположены таким образом, что занимают большее пространство. Соответственно, гидрофобность такого изомера выше, и его удерживание в обращено-фазовых условиях сильнее
Но как понять – насколько соединение гидрофобно? В первом и самом грубом приближении, чем хуже вещество растворяется в водной среде, тем выше его гидрофобность.
Количественной характеристикой гидрофобности иногда считают константу распределения вещества в двухфазной системе «октанол-вода». Чем большую долю вещества содержит октанольный слой, тем более оно гидрофобно и тем больше удерживается в ОФ режиме. Однако, традиционные обращенные фазы более гидрофобны, чем октанол, поэтому примение напрямую констант распределения в данной системе для оценки удерживания в ОФ режиме не вполне корректно.
И, наконец, если известна структурная формула соединения, то гидрофобность как некоторую количественную величину можно вычислить по одной из нескольких существующих аддитивных схем, суммируя известные инкременты (вклады) функциональных групп молекулы в удерживание. В специально посвященных этому вопросу статьях можно найти различные варианты таблиц с необходимыми инкрементами.
На практике опытный хроматографист пользуется, скорее, именно третьим способом оценки гидрофобности – по структурной формуле. Тем не менее, точными расчетами никто никогда в реальности не пользуется. Как опытный химик-синтетик со стажем, который по одной формуле предсказывает температуру плавления вещества, опытный хроматографист только по структурным формулам адсорбатов может сразу предсказать примерную последовательность элюирования в ОФ системе и примерно необходимую минимальную долю ацетонитрила в элюенте. Никакой мистики здесь нет – хроматографист с наработанными навыками просто помнит инкременты различных функциональных групп, что позволяет ему делать предсказания значительно быстрее, чем специализированные компьютерные программы-симуляторы.
Для любых оценок совершенно необходимо знать инкремент метиленовой CH2 группы (который также называется метиленовой селективностью) для применяемой неподвижной фазы. Инкременты метиленовой CH2 и метильной CH3 групп можно определить, получив хроматограмму любых трех гомологов, например, бензола, толуола и этилбензола (первые два вещества, как правило, всегда есть в лаборатории). Инкремент метильной группы, как правило, лишь немного больше инкремента метиленовой.
Если разделение проводится на С18 фазе с традиционной селективностью, то инкременты всех остальных функциональных групп можно привязать к инкременту метиленовой, приняв ее за 1. Так, фенил -С6Н5 увеличивает удерживание примерно как две-три метильные группы. Хлор увеличивает удерживание чуть больше, чем метил; бром по действию примерно равен полутора метильным, а йод – двум, почти как фенил.
Гидроксил -ОН, напротив, уменьшает удерживание, нейтрализуя действие примерно трех-четырех метильных групп. Подобным же образом ведет себя карбоксильная группа -СООН в молекулярной форме (кислая среда); несколько сильнее уменьшает удерживание протонированная аминогруппа -NR3+. Группы: ацетильная -С(О)СН3, нитро -NO2 и оксиметильная -O-CH2- (или -OCH3) – мало влияют на удерживание, в зависимости от положения в молекуле либо (чаще) немного уменьшая его, либо (реже) немного увеличивая.
Функциональные группы, способные к ионизации, уменьшают удерживание. Величина их воздействия зависит от рН элюента, поскольку от рН зависит соотношение молекулярной и ионизированной форм. Так, кислотная карбоксильная группа -СООН при низком рН < 3 находится в молекулярной форме. По этой причине она уменьшает удерживание умеренно, примерно так же, как гидроксильная группа -ОН. Например, бензойная кислота на С18 фазе при рН 3 имеет практически такое же удерживание, как и фенол. Но стоит сделать рН нейтральным, как карбоксил переходит в ионную, солевую форму -СОО-, и удерживание соединения резко уменьшается.
Все сказанное справедливо и для основных соединений с аминной функциональной группой -NH2. При высоком, щелочном рН > 11 аминогруппа находится в молекулярной форме и умеренно уменьшает удерживание. Удерживание начинает уменьшаться при переходе к нейтральному рН, и значительно уменьшается при переходе к низкому рН – поскольку аминогруппа переходит в ионную, солевую форму -NH3+.
Таким образом, в обращенно-фазовой хроматографии порядок элюирования соединений можно достаточно точно предсказывать по их структурным формулам – что бывает очень удобно при расшифровке хроматограмм и при разработке условий разделений. Кроме того, подбор состава элюента необходимой элюирующей силы также не занимает много времени. Для этого нужно лишь знать несколько реперных хроматографических систем (см. табл. 1).
Применяя описанную в главе 2.1.4 "универсальную" ОФ систему (НФ: С18 фаза, ПФ: ацетонитрил и водный буферный раствор с 1% триэтиламина, рН 2.5 фосфорной кислотой) можно элюировать большинство органических соединений; удерживание при этом регулируется долей ацетонитрила в элюенте. Например, для элюирования фруктовых органических кислот потребуется только водный компонент (0% ацетонитрила), для элюирования гликозидов – около 5-10% ацетонитрила, оксикоричных и бензойных кислот – 20-25%. Примерно столько же, 10-30% ацетонитрила, потребуется для элюирования большинства азотистых оснований при кислом рН < 3, или 20-40% при нейтральном рН ≈ 7. Фенолы элюируются при 30-60% ацетонитрила, моноароматика (гомологи бензола) – при 50-70%, би- и триароматика – при 60-80%.
В ОФ режиме селективность разделения практически не зависит от состава подвижной фазы и природы неполярной добавки (ацетонитрил, метанол, ТГФ). Другими словами, ОФ системы являются негибкими. Показательно, что в негибкости ОФ систем заключено одно из их преимуществ: по этой причине обращенно-фазовые разделения достаточно легко воспроизводить, причем даже на обращенных фазах различных марок, не говоря уже о применении элюентов различного состава.
Вообще говоря, вопрос – почему селективность ОФ систем слабо изменяется при варьировании состава элюента – довольно интересен. Для того, чтобы селективность оставалась постоянной для достаточно представительной выборки соединений, необходимо, чтобы величины взаимодействий «вещество-адсорбент» и «вещество-элюент» изменялись при переходе на новую подвижную (или неподвижную) фазу пропорционально, причем для любых соединений.
В ОФ системах это становится возможным, видимо, по двум причинам. Во-первых, для обращенно-фазовых систем без добавок специализированных модификаторов в элюент (например, ион-парных реагентов) динамическое (адсорбционное) модифицирование поверхности адсорбента выражена крайне слабо. Элюент, соответственно, практически не влияет на свойства адсорбента. Во-вторых, в водноорганической среде любое соединение фактически можно считать предельно сольватированным, т.е. варьирование в определенных рамках состава элюента не должно значительно влиять на строение адсорбционного комплекса. Таким образом, здесь исключаются оба фактора, которые отвечают за изменение селективности хроматографической системы при варьировании состава элюента.
Модель обращенно-фазовой системы, фактически, описывает два процесса: выталкивание предельно ассоциированных водой адсорбатов из водной среды и дисперсионное взаимодействие адсорбатов с неполярной подвижной фазой. На настоящий момент не поставлено достаточно надежного и однозначного эксперимента, который бы позволил разделить эти два фактора удерживания. Известно лишь, что для малополярных и среднеполярных соединений они действуют почти симбатно, и разделить их сложно.
Величина удерживания в обращенно-фазовом режиме, таким образом, должна хорошо описываться такой величиной как межфазное поверхностное натяжение, которая по смыслу соответствует свободной поверхностной энергии на границе раздела фаз "элюент-адсорбент". Однако, такого рода эксперименты так же не проводились (или же они не являются широко известными).
Полезным практическим следствием подобной модели можно считать наличие зависимости элюирующей силы ОФ подвижной фазы от ее поверхностного натяжения на границе с воздухом, которое можно легко измерить. С этой точки зрения можно легко объяснить ряд зависимостей удерживания в ОФ режиме:
- от концентрации неполярной добавки в элюенте (уменьшение поверхностного натяжения);
- от концентрации неорганических солей в элюенте (увеличение поверхностного натяжения);
- резкая зависимость удерживания от температуры (уменьшение поверхностного натяжения).
Любой обращенной неподвижной фазе (так же, как и адсорбату) можно приписать определенную гидрофобность. Чем выше гидрофобность фазы, тем сильнее удерживание в обращенно-фазовых условиях. Наименее гидрофобна С1 фаза, далее идует С4 фаза и цианопропильная CN фаза, далее – С8, С16, С18 фазы. Гидрофобность С8-С18 фаз уже зависит не от количества атомов углерода в привитом реагенте (то есть 8 или 18), а от массовой доли углерода для данной привитой силикагельной С8-С18 фазы. У самых гидрофобных С18 фаз доля углерода приближается к 20%. Большей массовой долей углерода обладают только С30 фазы.
Значительно большей гидрофобностью, чем фазы на основе силикагеля, обладают полимерные неподвижные фазы на основе полистирола. Самая гидрофобная полимерная фаза – это полистирол-дивинилбензол (ПС-ДВБ) высокой сшивки и сверхсшитый полистирол. Для них работает эмпирическое правило: чтобы получить удерживание как на С18 фазе, объемную долю неполярной добавки (например, ацетонитрила), необходимо увеличить вдвое. Большей, чем сверхсшитый полистирол, гидрофобностью обладают лишь углеродные фазы. Гидрофобность полимерных фаз на основе метакрилатов примерно соответствует таковой для С18-С30 фаз на основе силикагеля.
На протяжении последних двух десятилетий разработка неподвижных фаз для обращенно-фазовой хроматографии на основе силикагеля шла по пути решения сразу нескольких практических задач:
- повышения их химической инертности фаз;
- повышения их гидролитической стабильности фаз (времени жизни);
- синтеза фаз, полностью совместимых с 100% водными элюентами;
- синтеза фаз для разделения высокогидрофобных соединений.
Под химической инертностью фаз на основе силикагеля понимают отсутствие нежелательных, т.н. активных адсорбционных центров на поверхности адсорбента. Множественные и достаточно медленные взаимодействия адсорбатов с активными адсорбционными центрами (имеющие в основном характер хелатирования и ионного обмена) являются одной из главных причин уширения и искажения формы хроматографических пиков при обращенно-фазовом хроматографировании ионных соединений, особенно азотсодержащих оснований.
Типичные активные адсорбционные центры силикагеля – это примесные ионы металлов, а также возникающие под их влиянием силанольные группы повышенной кислотности, т.н. активные силанолы.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пример тестирования обращенных С18 фаз на химическую инертность. НФ: (а) современный С18 силикагель, (б) С18 силикагель старого типа. ПФ: 18% ацетонитрила в 15 мМ фосфатном водном буферном растворе, рН 7. 1 - кодеин, 2 - метиламиноантипирин (продукт деградации анальгина), 3 - фенобарбитал. www.chromforum.ru
Рисунок 91. Пример тестирования обращенных С18 фаз на химическую инертность. НФ: (а) современный С18 силикагель, (б) С18 силикагель старого типа. ПФ: 18% ацетонитрила в 15 мМ фосфатном водном буферном растворе, рН 7. 1 - кодеин, 2 - метиламиноантипирин (продукт деградации анальгина), 3 - фенобарбитал
Гидролитическая стабильность фазы на основе силикагеля определяет время жизни хроматографической колонки. Любой силикагель со временем гидролизуется, растворяется, что приводит к выходу колонки из строя. Очень быстро процесс растворения идет в щелочной среде, поэтому фазы на основе силикагеля нельзя применять при рН > 7. Но и при подкислении элюентов до рН < 2, при добавлении в элюент солей гидролитические процессы также ускоряются. Более того, эти процессы активно катализируются примесными ионами металлов, которые содержит в себе силикагель.
Таким образом, для улучшения химической инертности и гидролитической стабильности силикагельных фаз необходимо уменьшать содержание в последнем примесных ионов металлов. В настоящее время этого добиваются не обработкой некачественного силикагеля, а путем синтеза силикагеля по золь-гель (sol-gel) технологии. В отличие от силикагеля, получаемого по традиционной технологии – осаждением геля кремниевой кислоты из водного раствора силикатов – в золь-гель технологии силикагель синтезируется каталитической поликонденсацией силоксанов в водной среде:
Si(OC2H5)4 + 4H2O = Si(OH)4 + 4C2H5OH
nSi(OH)4 = (SiO2)n + 2H2O
Главная отличительная черта золь-гель силикагеля – крайне низкое содержание примесей металлов, на два-три порядка ниже, чем в силикагеле, получаемом по традиционной технологии. Кроме того, золь-гель силикагель отличается и по своей физической структуре (см. табл. 12). Золь-гель силикагели могут быть приготовлены с различным размером пор и различной величиной удельной поверхности.
Таблица 12. Характеристики силикагелей
Другой подход состоит в получении гидролитически стабильной обращенной фазы в один шаг, путем полимеризации триэтоксисиланов типа CH3Si(OR)3 и (RO)3SiCH2CH2Si(OR)3, где R – углеводородный радикал. Иногда такие материалы называют гибридными.
Существуют и другие способы увеличить гидролитическую стабильность и химическую инертность обращенных фаз на основе силикагеля. Так или иначе, все они связаны с технологией прививки С18 или иных реагентов на силикагельную основу.
Классическим способом можно считать эндкэппинг (endcapping). После прививки С18 или иного реагента около двух третей силанольных групп остается свободными, не прореагировавшими. Они закрываются (эндкэппируются) другим, низкомолекулярным реагентом, как правило, триметилхлорсиланом или диметилдихлорсиланом. Эндкеппинг обоими реагентами называют двойным эндкеппингом.
Вот краткий перечень основных технологических решений для получения обращенных фаз на основе силикагеля, характеризующихся высокой химической инертностью и гидролитической стабильностью:
1. Проведение интенсивного двойного эндкеппинга триметилхлорсиланом и/или диметилдихлорсиланом. К таким фазам относятся большинство современных С18 силикагелей, которые позиционируются производителями как традиционные фазы для разделения органических оснований (иногда в их названии присутствует аббревиатура "Basic").
2. Проведение С18 прививки не монохлорсиланами, а дихлорсиланами, что приводит к дополнительной сшивке привитых реагентов между собой рядом с поверхностью силикагеля. Фазы с такой прививкой называют "polymeric C18" в отличие от традиционных "monomeric C18".
3. Прививку лигандов Cl-Si(R2)C18H37 с объемными боковыми заместителями R, бидентантных лигандов с общей формулой Cl-Si(CH3)2-R-(CH3)2Si-Cl.
На элюентах с большой долей водной основы, 90% и более, обращенно-фазовое разделение может пострадать от неприятного эффекта – фазового коллапса (dewetting). Его признаки таковы: после остановки потока, в течение небольшого времени порядка нескольких часов, удерживание всех компонентов резко падает, а пики уширяются. В пределе все разделение превращается в один широкий неудерживаемый пик. Если промыть колонку ацетонитрилом, а затем вновь повторить анализ, то разделение снова будет в норме.
Фазовый коллапс происходит из-за того, что неполярная поверхность С18 фазы перестает смачиваться элюентом, обедненным органическим растворителем, и элюент просто перестает проникать в поры адсорбента. Соответственно, поры перестают работать, что и приводит к резкому уменьшению удерживания всех соединений.
Для того, чтобы неполярная фаза была устойчива к фазовому коллапсу (другими словами, чтобы она была полностью совместима с 100% водными элюентами), ее поверхность все-таки должна содержать некоторое минимальное количество полярных групп. Оставлять С18 силикагельный адсорбент полностью неэндкеппированным – это не выход; удерживание на неэнкеппированных фазах очень часто плохо воспроизводится от партии к партии (batch-to-batch reproducibility).
Одним из первых решений была прививке к силикагелю неполярных С16-С18 лигандов, содержащих, однако, в своей структуре внедренную полярную группу (polar-embedded group): карбаматную, простую эфирную или амидную – которая находится рядом с поверхностью адсорбента. Наиболее широкое распространение получила С16-амидная фаза, которая получается реакцией ангидрида С16 карбоновой кислоты с аминопропилированным силикагелем.
Другим решением стало применение полярного эндкэппинга (polar end-capping) – эндкэппинга реагентами с полярной функциональной группой.
Обращенные фазы со внедренной полярной группой и полярным эндкэппингом оказались действительно полностью совместимы со 100% водными элюентами. Тем не менее, у них оказался серьезный недостаток, который практически нивелировал преимущество работы с водными элюентами. Смысл перехода на 100% водные элюенты в ОФ режиме состоит в увеличении удерживания наиболее полярных, гидрофильных веществ. Разработанные же неподвижные фазы из-за внедрения полярных групп значительно потеряли в гидрофобности, т.е. даже на полностью водных подвижных фазах удерживание гидрофильных соединение оказывалось весьма посредственным.
Таким образом, фазы подобного типа, изначально сконструированные для работы с 100% водными элюентами, в настоящее время имеют совсем другое назначение. Их применяют как фазы, обеспечивающие смешанный обращенно-фазовый/нормально-фазовый режим удерживания, т.е. используют их отличающуюся от традиционных С18 фаз селективность.
Что касается технологии синтеза обращенных фаз, устойчивых в 100% водных элюентах, и при этом обеспечивающих высокое удерживание гидрофильных соединений – в настоящее время подобные технологии ревностно охраняются производителями. В описании таких фаз нередко можно встретить слово proprietary, то есть химия фазы засекречена. В основном, данные технологии подразумевают проведение энкеппинга различными неполярными объемными реагентами при строгом контроле глубины проведения реакции.
В названии обращенных фаз, совместимых с 100% водными элюентами, как правило, присутствует аббревиатура "AQ" или "Aqua". При этом, к сожалению, по названию нельзя догадаться о величине удерживания на колонке гидрофильных соединений. К примеру, колонки с полярным эндкеппингом тоже могут содержать в названии "Aqua" или "Hydro"; если производитель при этом скрывает, что данная фаза – с полярным энкеппингом, то понять – подходит ли эта колонка для разделения гидрофильных соединений – становится невозможно. Установить ее пригодность можно только протестировав ее, к примеру, по фруктовым органическим килотам (см. рис. 92). На подкисленной воде на типоразмере 250х4.6 при скорости потока 1 мл/мин лимонная кислота должна элюироваться около 8-12 минут, не раньше.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограмма лимонного сока на 250х4.6 колонке с С18 адсорбентом. Скорость потока 1.5 мл/мин. ПФ: вода, рН 2.5 фосфорной к-той. 1 - аскорбиновая кислота, 2 - лимонная кислота. www.chromforum.ru
- 93_1.jpg (13.79 Кб) Просмотров: 12410
Рисунок 92. Хроматограмма лимонного сока на 250х4.6 колонке с С18 адсорбентом. Скорость потока 1.5 мл/мин. ПФ: вода, рН 2.5 фосфорной к-той. 1 - аскорбиновая кислота, 2 - лимонная кислота
Для разделения липидов методом обращенно-фазовой хроматографии, как правило, применяют безводные подвижные фазы, содержащие такие липофильные добавки как ТГФ, ацетон, хлороформ. Применение С18 привитых силикагелей в сочетании с подобными слабополярными элюентами может привести к ухудшению эффективности разделения, которое, по-видимому, происходит из-за нарушения структуры привитого слоя. Для эффективной работы в неполярных подвижных фазах выпускают силикагели с С30Н62 привитыми лигандами – С30 фазы; фазы такого типа применяются для разделения триглицеридов, жирорастворимых витаминов, каротиноидов.
Многие формально обращенные фазы характеризуются селективностями, отличными от селективности традиционных С18 фаз. Различие в селективности обусловлено вкладами одного или нескольких режимов удерживания в дополнение к основному обращенно-фазовому. Вклад нормально-фазового режима наиболее ярко проявляется на карбаматных и амидных обращенных фазах, а также на фазах с полярным эндкеппингом.
Среди полимерных фаз смешанный обращенно-фазовый/нормально-фазовый режим удерживания реализуется на метакрилатных фазах (см. рис. 93).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограммы кофе на трех неподвижных фазах в обращенно-фазовых условиях. НФ: (а) С18 фаза, (б) С16-амидная фаза, (в) полиметилметакрилатная фаза. ПФ: 12% ацетонитрила и 0.5% фосфорной к-ты в воде. 2 - кофеин; 1,3,4 - изомеры хлорогеновой кислоты. Детектирование: 270 нм (сплошная линия), 330 нм (пунктирная линия). www.chromforum.ru
Рисунок 93. Хроматограммы кофе на трех неподвижных фазах в обращенно-фазовых условиях. НФ: (а) С18 фаза, (б) С16-амидная фаза, (в) полиметилметакрилатная фаза. ПФ: 12% ацетонитрила и 0.5% фосфорной к-ты в воде. 2 - кофеин; 1,3,4 - изомеры хлорогеновой кислоты. Детектирование: 270 нм (сплошная линия), 330 нм (пунктирная линия)
Вклад режима с переносом заряда проявляется при хроматографировании ароматических соединений в обращенно-фазовых условиях на фазах, содержащих ароматические π-донорные/акцепторные фрагменты. Специализированными фазами такого типа являются пентафторфенильная (PFP) и пиренильная (PYE) фазы на основе силикагеля.
Значительный вклад режима с переносом заряда наблюдается для всех полистирол-дивинилбензольных обращенных фаз (см. рис. 94). Фактически, в смешанном обращенно-фазовом/с переносом заряда режиме работают пористые графитированные сажи типа Hypercarb.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделения моно-, би- и трициклических углеводородов на С18 силикагеле (а) и сверхсшитом полистироле (б) в условиях обращенно-фазовой хромтаографии. 1-I – бензол, 2-I – толуол, 3-I – о-ксилол, 4-I – кумол, 1-II – нафталин, 2-II – флуорен, 3-II – 2,7-диметилнафталин, 1-III – фенантрен, 2-III – антрацен. www.chromforum.ru
Рисунок 94. Разделения моно-, би- и трициклических углеводородов на С18 силикагеле (а) и сверхсшитом полистироле (б) в условиях обращенно-фазовой хромтаографии. 1-I – бензол, 2-I – толуол, 3-I – о-ксилол, 4-I – кумол, 1-II – нафталин, 2-II – флуорен, 3-II – 2,7-диметилнафталин, 1-III – фенантрен, 2-III – антрацен
Для перехода в смешанный обращенно-фазовый/ионный режим, как правило, применяют динамическое модифицирование С18 фаз ион-парными реагентами, придающими неполярной поверхности некоторый положительный или отрицательный заряд. В то же время, существуют фазы, созданные специально для работы в этом смешанном режиме. Они бывают как на основе силикагеля со смешанной С18/сульфопропильной или С18/триметилпропиламмониевой прививкой, так и на основе полистирол-дивинилбензольных фаз – это иониты на ПС-ДВБ основе высокой сшивки и сверхсшитых полистиролах.
Обращенные неподвижные фазы с дополнительным вкладом эксклюзионного режима часто называют фазами с ограниченно доступной поверхностью, ОДП (restricted access media, RAM). Они применяются для анализа проб, содержащих высокомолекулярные примеси, либо без, либо с минимальной подготовкой пробы. Особенно актуальны такие фазы при анализе биологических проб, которые содержат большое число загрязняющих соединений белковой природы, и экологических проб, которые могут содержать гуминовые кислоты и другие природные полимеры.
ОДП фазы на основе силикагеля получают двумя путями. В первом варианте после прививки С18 лиганда на поверхность силикагельной частицы прививают полимерную полиэтиленгликолевую "сетку", пропускающую в поры только низкомолекулярные соединения. Во втором варианте на силикагельную основу в дополнение к С18 лиганду прививают реагенты с длинной углеводородной цепочкой и полярной группой на конце (например, диольной) – такая преграда оказывается непреодолимой для гидрофильных белков.
Перспективным ОДП материалом является микропористый сверхсшитый полистирол (см. рис. 95). В этом материале нет классических пор диаметра 60-120 анстрем – есть полимерная жесткая трехмерная сетка с характерным размером ячейки около 30 ангстрем. Из-за небольшого диаметра "пор" адсорбент эксклюдирует не только полимерные, но и просто большие молекулы, особенно со структурой жесткого стержня (например, каротиноиды), а также любые гликозиды.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограмма п-хлорфенола и толуола на фоне матрицы почвы. НФ: 250x4.6 сверхсшитый полистирол (5мкм). ПФ: ацетонитрил-метанол-вода 45:50:5 (0.1% HClO4): 1 – п-хлорфенол, 2 – толуол. www.chromforum.ru
Рисунок 95. Хроматограмма п-хлорфенола и толуола на фоне матрицы почвы. НФ: 250x4.6 сверхсшитый полистирол (5мкм). ПФ: ацетонитрил-метанол-вода 45:50:5 (0.1% HClO4): 1 – п-хлорфенол, 2 – толуол
