Главы 1.3.-1.4. Техника подготовки проб для ВЭЖХ и ГХ

[Константин Сычев]

Поставка ВЭЖХ оборудования Agilent и Gilson http://www.chromforum.ru/viewforum.php?f=47

1.3. Разрушение эмульсий и коагуляционных структур

2.3.1. Типы дисперсных систем

Термином «диспергирование» обозначают процесс измельчения твердого тела или жидкости в определенный среде, который приводит к появлению новой, т.н. дисперсной фазы. В зависимости от агрегатного состояния диспергируемой фазы и среды выделяют следущие типы дисперсных систем: суспензии (тв./жидк.), аэрозоли (тв./газ.), эмульсии (жидк./жидк.), жидкие пены (жидк./газ.).
Кроме того, в зависимости от размера частиц дисперсные системы делят на грубые (с более крупными частицами) и тонкие (с мелкими частицами). К примеру, эмульсии подразделяют на грубые эмульсии, эмульсии, и микроэмульсии (лиозоли). Суспензии подразделяют на взвеси, суспензии и золи.
Образование дисперсной системы не является самопроизвольным процессом; для ее появления небходимо совершить некоторую работу, которая увеличивает полную энергию системы на величину свободной поверхностной энергии. Поскольку термодинамическая система стремится к состоянию с минимальной энергией, любая дисперсная система является термодинамически неустойчивой. Это значит, что измельченная фаза при любой возможности будет самопроизвольно укрупняться, пытаясь восстановить целостность исходной фазы.
Тем не менее, существуют кинетически стабильные дисперные системы, которые не разрушаются в течение значительного времени. Это значит, что на них оказывают влияние те или иные стабилизирующие факторы, в том числе образование на поверхности частиц двойного электрического слоя, формирование структурно-механического барьера и т.д.
По характеру нестабильности дисперсные системы разделяют на коагуляционно-неустойчивые и седиментационно-неустойчивые.
Седиментационно неустойчивыми являются системы, в которые частицы дисперсной фазы по прохождении некоторого времени выделяются в виде осадка; к примеру, седиментационно неустойчивыми нередко являются грубые дисперсии. Тонкодисперные системы могут стать седиментационно неустойчивыми вследствие процессов коагуляции.
Термином «коагуляция» обозначают слипание мелких частиц в более крупные частицы и структуры.
Образование крупных частиц, по сути, означает переход тонкодисперсной системы в грубодисперсную. В случае жидких частиц этот процесс называется коалесценцией (например, выпадение дождя – это пример коалесценции).
Более сложный процесс происходит, когда при слипании из мелких частиц образуются достаточно стабильные сложные структуры, которые называются коагуляционными.
Коагуляционной структурой в жидкой среде является желеобразная масса – гель. Гели могут возникать как в виде рыхлого осадка, так и в виде достаточно плотной массы по всему объему первоначальной жидкой фазы. Гели с водной дисперсной средой называют гидрогелями, с органической (часто углеводородной) – органогелями. Образованию гидрогелей способствует присутствие в системе ионных ПАВ, а образованию органогелей – неионных ПАВ.

2.3.2. Техники разрушения дисперсных систем

При проведении подготовки пробы образование дисперсной системы любого типа является крайне нежелательным процессом. Особенно много проблем возникает с гелями и пенами, которые, образуясь на границе раздела фаз, серьезно затрудняют их физическое отделение друг от друга. Помимо этого, дисперсная фаза всегда содержит в себе определенную долю экстрагируемых целевых соединений, которые невозможно выделить, не разрушив эту фазу.
Наибольшую проблему представляют гели. Для борьбы с ними применяют т.н. «вымораживание», то есть замораживание образца (полное или частичное) с последующим его оттаиванием. Температура, при которой выдерживают образец, может быть весьма низкой, обычно от -10°С до -30°С, но возможно и ниже; предел отрицательной температуры ограничен в основном применяемыми техническими средствами.
Применение вымораживания далеко не всегда приводит к разрушению геля, особенно если матрица образца содержит достаточные количества стабилизирующих гель веществ (к примеру, низко- и высокомолекулярных ПАВ). Тем не менее, в результате этой процедуры рыхлые гели, как правило, уплотняются. Плотная структура содержит меньше т.н. «неподвижного растворителя», то есть, в данном случае, экстракта; таким образом, проведение вымораживания приводит к сокращению потерь целевых соединений. Более того, в отличие от рыхлой структуры плотный осадок значительно легче отделяется от экстракта.
Для обработки экстрактов в неполярных органических растворителях, которые содержат эмульсию и/или небольшие количества геля, применяют подход, основанный на комбинировании механического и адсорбционного воздействия. Экстракт пропускают через небольшую колонку или фильтр со слоем ваты (верхний слой) и небольшим количеством неорганической соли (нижний слой). В самом простом варианте применяют хлорид натрия или безводный хлорид кальция (гранулы соли не должны быть слишком мелкими, экстракт должен фильтроваться без затруднений). Такой фильтр разбивает гель, а также поглощает часть влаги и стабилизирующих дисперную фазу поверхностно-активных веществ. Главное в этом подходе – чтобы вата или соль не адсорбировали целевые соединения.
Наконец, для разрушения обратных эмульсий (то есть эмульсий водной фазы в органическом растворителе) нет никакой необходимости прибегать к каким-либо специальным способам – вполне достаточно провести стандартную процедуру осушения экстракта при помощи безводного сульфата натрия или хлорида кальция.
Для разрушения прямых эмульсий (то есть эмульсий в водной фазе), стабилизирующихся, как правило, в присутствии ионных ПАВ, применяют целый ряд методов: добавляют концентрированные растворы электролитов, изменяют рН, нагревают экстракт. Успех того или иного подхода во многом зависит от типа матрицы, поэтому эффективность его применения оценивают эмпирически.
Для разрушения пен на границе раздела водной и органической фаз применяют небольшие добавки спиртов: этанола, изопропанола.
Тонкие суспензии эффективно коагулируют под воздействием небольших добавок специальных полиэлектролитов – флокулянтов. Для осаждения суспензий из водных сред чаще всего применяют широко доступные полиакриламид (ПАА) и поливиниловый спирт (ПВА). Хлопьевидные агрегаты (флокулы), образовавшиеся в результате коагуляции, удаляют центрифугированием.


1.4. Жидкостная экстракция твердых матриц

1.4.1. Специфика и техники жидкостной экстракции твердых матриц

Твердые образцы не могут быть проанализированы хроматографическими методами напрямую. По этой причине целевые соединения вначале переводят из твердой матрицы в жидкую фазу (жидкостная экстракция) или газообразную фазу (парофазная экстракция). Применение парофазной экстракции ограничено извлечением летучих соединений, поэтому этом метод не универсален. Таким образом, жидкостная экстракция является наиболее распространенным методом извлечения целевых соединений из твердых матриц.
Техники проведения жидкостной экстракции твердых матриц имеют рад особенностей, не характерных для жидкость-жидкостной экстракции.
Для проведения экстракции методом ЖЖЭ необходимо на некоторое время диспергировать обе жидкие фазы (образца и экстрагента) друг в друге, чтобы увеличить скорость достижения адсорбционного равновесия. Для подобного грубого диспергирования необходимо совсем небольшое по мощности воздействие, причем низкой частоты (к примеру, достаточно простого ручного встряхивания). В свою очередь, чтобы диспергировать твердую матрицу, ее необходимо разрушить. Если матрица прочная, для этого может понадобиться довольно мощное воздействие, в ряде случаев – высокой частоты.
Облегчить процесс разрушения твердой матрицы можно путем адсорбционного снижения ее прочности. Первый вариант состоит в правильном выборе растворителя, который должен не только хорошо растворять целевые соединения, но и способствовать легкому разрушению матрицы. Общая закономерность состоит в том, что полярные растворители снижают прочность полярных матриц (особенно эффективны добавки воды), а неполярные растворители снижают прочность неполярных матриц.
Второй вариант состоит в применении экстрагентов с добавками поверхностно-активных веществ, или детергентов, которые наиболее эффективно снижают межфазное поверхностное натяжение и, соответственно, значительно облегчают диспергирование (то есть разрушение) твердых матриц. Оба подхода, разумеется, можно сочетать.
Еще одно отличие от ЖЖЭ состоит в том, что даже если твердый образец диспергирован, диффузия веществ из твердой матрицы в экстрагент может оказаться очень медленной. Это характерно для образцов, в которых целевые соединения не концентрируются преимущественно в порах твердых частиц, а распределены относительно равномерно внутри их объема.
К факторам, эффективно ускоряющим диффузию, относят температуру и давление. Высокая температура приводит к снижению вязкости экстрагента, и высокое давление буквально «вгоняет» высокотекучую жидкость даже в мельчайшие поры твердой матрицы.
Наконец, даже на поверхности пор целевые соединения могут весьма сильно удерживаться за счет адсорбционных взаимодействий. Таким образом, применяемый экстрагент должен не только хорошо растворять целевые вещества, но и обладать по отношению к ним и к матрице высокой элюирующей силой (см. гл. «Адсорбционные режимы»).
Экстрагент пытаются подобрать таким образом, чтобы он отвечал целому ряду требований; по этой причине, для экстракции твердых матриц нередко применяют смеси различных растворителей. Смеси растворителей, однако, нельзя регенерировать (за исключением азеотропных смесей); применение индивидуальных растворителей с этой точки зрения выглядит более практично. С другой стороны, многие аналитики считают практику применения регенерированных растворителей в химическом анализе неприемлемой в принципе.
Техники проведения экстракции могут весьма сильно отличаться друг от друга, но между ними есть, безусловно, и много общего. Так, перед проведением экстракции образец стараются предварительно измельчить, то есть максимально разрушить твердую, и нередко весьма прочную, матрицу. Измельчение, как правило, производят механическими автоматизированными методами; для эластичных образов применяют режущее воздействие, для неэластичных – дробящее.
Для более мелкого помола в образец нередко добавляют абразив. К примеру, при жидкостной экстракции продуктов питания предварительно измельченный образец (после взятия навески) перетирают с безводным сульфатом натрия, который играет сразу три роли: абразива, осушителя и высаливающего реагента.
Как правило, экстракцию твердых образцов, содержащих влагу, проводят неполярными растворителями, не смешивающимися с водой. Однако, существует специальная техника экстракции полярными, смешивающимися с водой растворителями.
В этой технике применяемый растворитель-экстрагент должен обладать свойством выделяться в отдельную фазу при внесении в водноорганический раствор неорганической соли. Так ведут себя ацетонитрил, ТГФ, диоксан; как правило, для экстракции применяют ацетонитрил. В качестве высаливающего реагента в данном случае применяют безводный сульфат магния, который в том числе работает как абразив.
Предварительно измельченный образец перетирают с сульфатом магния и ацетонитрилом. Эффективно проделать это вручную невозможно, так что процесс должен быть автоматизирован. Далее без заминки (поскольку вобравший влагу сульфат магния быстро схватывается в твердую массу) декантируют экстракт и отбирают его аликвоту. Полученный в результате такой процедуры ацетонитрильный экстракт имеет очень малую, менее 1%, долю влаги, а также, что крайне важно, содержит минимум липидов и насыщенных углеводородов.
Одним из способов перевода в раствор матриц, содержащих жиры, белки, углеводороды и другие природные олигомеры, является гидролиз. Применяют кислотный, щелочной или ферментативный гидролиз. Для гидролиза жиров, как правило, применяют щелочной гидролиз раствором гидроксида калия в смеси этанола с водой. Гидролиз является морально устаревшей техникой, весьма трудоемкой и ресурсоемкой.
Кроме того, полученный гидролизат необходимо экстрагировать неполярным растворителем при повышенной температуре (иначе омыленные продукты застывают, что делает проведение ЖЖЭ невозможным). Во-первых, это крайне неудобно технически – экстрагент в процессе буквально закипает в делительной воронке. Во-вторых, результатом экстракции гарантированно является тяжело отделяемая от образца эмульсия или гель. Таким образом, гидролиз целесообразно применять только как вариант дополнительной обработки водных образцов, содержащих жиры и/или белковые соединения.
Наконец, в ряде случаев твердый образец может быть переведен в жидкую фазу при помощи растворения. Подход очень заманчив: в результате экономятся реагенты, время, труд, улучшается правильность и воспроизводимость измерений – поэтому если ситуация дает принциальную возможность применять его, то это надо делать.

1.3.2. Техническое оформление экстракции твердых матриц. Традиционные системы. Автоматизированные системы экстракции под давлением

Традиционным способом извлечения веществ из твердых матриц является экстракция в аппарате Сокслета. Образец, помещенный в патрон из пористого материала (или обернутый в стекловолокно), непрерывно экстрагируется чистым растворителем, получаемым в результате в циклического процесса регенерации из экстракта. Этот подход, безусловно, является весьма ресурсоемким (требует применения порядка 100 мл эктрагента), но главное – медленным; он занимает от 6 до 48 часов. Низкая скорость экстракции обусловлена тем, что температура поступающего в отделение с образцом экстрагента низкая – тепло теряется при его прохождении через обратный холодильник прибора.
Этот недостаток частично устранен в аппаратах для автоматизированной экстракции методом Сокслета. На первой стадии пористый стакан с образцом находится в колбе для приема экстракта, где образец около часа экстрагируется обычным кипячением в экстрагенте. Затем следует стадия экстракции по обычной схеме Сокслета (также около часа), после чего растворитель автоматически отгоняется из экстракта; его конечный объем составляет 1-2 мл.
Экстракцию под воздействием ультразвука проводят при помощи ультразвуковой ванны или обычного ультразвукового экстрактора с металлическим стержнем. Процесс эстракции очень быстрый, порядка 10-20 минут или менее, и простой – достаточно поместить стакан с измельченным образцом и экстрагентом в ультразвуковую ванну и запустить процесс. Метод оптимален для разрушения весьма твердых, но при этом хрупких матриц; эффективность повышается при сочетании обработки ультразвуком с применением экстрагентов, содержащих добавки поверхностно-активных веществ.
Многие исследователи отмечают недостаточную универсальность ультразвуковой экстракции, что во многом справедливо. Обработку ультразвуком хорошо применять как предварительную стадию эктракции, направленную, прежде всего, на разрушение структуры твердой матрицы. Экстракцию под воздействием ультразвука, к примеру, можно комбинировать с экстракцией в аппарате Сокслета или микроволновой экстракцией.
Микроволновая экстракция осуществляется путем воздействия на образец с экстрагентом микроволнового излучения, которое приводит к их разогреву. Теплотворная мощность сильно зависит от полярности растворителя-экстрагента. Быстро и сильно разогреваются полярные растворители с низкой диэлектрической проницаемостью: спирты, ацетон, ацетонитрил, дихлорметан. Также эффективно действует вода в виде добавки в экстрагент на уровне 10-15%. В то же время, углеводородные растворители: гексан, толуол – разогреваются плохо, поэтому их необходимо смешивать с более полярными растворителями (например, с ацетоном).
Микороволновые экстракторы бывают открытого и закрытого типа. В экстракторах открытого типа процесс экстракции проходит в колбе, которая через обратный холодильник соединена с атмосферой. Микроволновое излучение фокусируется на дне колбы, где находится образец. За один раз таким способом можно проэкстрагировать только один образец.
Напротив, применение экстрактора закрытого типа позволяет одновременоо экстрагировать несколько образцов. Процесс проходит в герметичной капсуле, которая способна выдерживать значительное давление (порядка 100 атм и даже выше). Время экстракции составляет порядка 10-20 минут, и еще около 20 минут необходимо для того, чтобы капсула остыла.
К преимуществам метода относят высокую эффективность и скорость. Недостатки: возможность разложения целевых веществ при высокой температуре и неизбирательность экстракции, которая приводит, как правило, к необходимости дополнительной очистки экстрактов. Микроволновая экстракция особенно хорошо зарекомендовала себя как метод выделения соединений из сложных, разнородных по составу матриц, содержащих жиры, жировые основы, сажу, полимеры, растительные остатки; метод также применяется для извлечения лекарственных веществ из таблетированных форм.
Одной из наиболее современных техник экстракции твердых матриц является жидкостная экстракция под давлением (ЖЭД, PLE), или, в другом варианте, ускоренная жидкостная экстракция (ASE); существование различных названий обусловлено тем, что оборудование выпускается конкурирующими компаниями.
Экстракция проводится при повышенной (до 100-150°С) температуре и повышенном (до 100-120 атм.) давлении традиционными растворителями в специальных стальных ячейках, которые напоминают ВЭЖХ колонки. Ячейки могут быть различного объема. Они находятся в термостате; растворители подаются насосом высокого давления; миксер на стороне низкого давления позволяет смешивать различные растворители-компоненты экстрагента в требуемом соотношении. В процессе экстракции насос периодически подает в ячейку небольшие объемы экстрагента; готовый экстракт постепенно подается в приемную емкость.
ЖЭД является весьма экономной, быстрой, эффективной и полностью автоматизированной техникой экстракции. Она широко применяется для извлечения стойких органических загрязнителей из различных матриц. Достаточно существенные затраты на ЖЭД экстрактор более чем окупаются высокой производительностью и низкой ресурсоемкостью этой системы.
Система жидкостной экстракции под давлением может быть дополнена автоматизированной системой колоночной хроматографии для очистки экстрактов, а также автоматизированной системой отгонки растворителя. Их применение снижает трудоемкость процедуры очистки, но существенно повышает ресурсоемкость всей процедуры в целом; кроме того, стоимость автоматизированных систем колоночной хроматографии достаточно высока.