Макролид на полимерной стирол-дивинилбензольной колонке

[Polina]

Добрый день, уважаемые коллеги. Расскажу продолжение страшной сказки про макролиды-антибиотики на заморской полимерной ВЭЖХ колонке уважаемого Dr.Maisch. Это можно сказать, продолжение темы http://www.anchem.ru/forum/read.asp?id=11524. В общем, путем нечеловеческих поисков получила я эту колонку, купленную хитроумным отделом снабжения какими-то окольными путями. Ибо в коробке кроме колонке, никаких минимальных рекомендаций по уходу и хранению не было. Известно, что это сополимер стирола-дивинилбензола. Теперь вот бьюсь с ней...ибо методика не сработала при анализе Эритромицина.
Условия.Температура 70С, 50мл фосфатный буферный раствор рН=9 + с 30мл MeCN + 165 мл трет-бутилового спирта на 1л смеси, водой до метки. 2мл в мин. 150бар. 70С термостат. УФ 215нм. Определяются Эритромицин A, B, C и ряд примесей. Концентрация "виновника торжества" 4мг/мл. Такой уж он...плохо поглощающий. И вообще, не подарочный. Растворяли его в смеси 1/3 метанол/фосфатный буфер рН=7.0.
Хроматографирую в указанных условиях - ничего. Делаю бланк в подозрении на всплески в начале хр-мы - бланк идентичен испытуемому раствору (то есть ничего). Варьирую концентрацию трет-бутанола вплоть до увеличивания вдвое - ничего. Варьирую буфера концентрацию (увеличиваю вдвое) - как бы это сказать, ничего. Пытаюсь уменьшить удерживание с помощью понижения температуры (слышала про такую тенденцию для макролидов) - эх, ничего. Мыла я ее...вода с метанолом, вода с ацетонирилом, домылась до чего-то лишь на 85% ацетонитрила. Думала, 30мл ацетонитрила в ПФ - как промежуточный сольвент, а оказывается...Как вот теперь быть, не придумала еще. Не хочеться думать, что такая совсем дурацкая метода (фармакопея Европы все-таки), тем более что нашла в нете статьи, где люди делали обширный межлабораторный эксперимент, и получался у них Э. на 10-15мин. В 5 или 6 разных лабах.
Грешу на колонку...Что скажете, уважаемые спецы? Прошу совета.

[Константин Сычев]

Добрый день, Полина! Хорошо, продолжаем ту тему. Итак, мое предсказание в первом приближении сбылось - не стоило верить той статье. Теперь будем думать что делать.

Для начала, полимерные колонки - это не силикагельные колонки. Это вообще нечно принципиально иное. Все Ваши представления о колонках, основанные на силикагеле, здесь могут не работать. Я кое-что постарался прикрепить к теме как файл, чтобы Вы почитали - но пока что-то не смг сделать этого - думаю, за день разберемся.

Кое-какие замечания по ходу..

1. Доля ацетонитрила должна быть примерно вдвое выше, чем на С18 фазах. Не надо в элюент замешивать всякую непонятную гадость. Про спирты (любые) вообще забудьте. Если элюируется нечто, по гидрофобности больше толуола - лучше перейти на ТГФ.
2. Не надо ее греть вообще, не надо гонять на 2 мл/мин - 1 кубика достаточно. Если удерживание выбокое - добавьте ацетонитрила.
3. Работу начинайте строго с тестовой хроматограммы. Достаточно вообще одного пика, но моя оригинальная тестовая смесь на полимерных колонках такая: ацетон, пиридин, бензальдегид, п-хлорфенол, толуол, кумол. Можно смотреть по толуолу. На 210 нм пик должен быть в пределах 1 AU по поглощению. Элюент - например, 90% ацетонитрила, 10% воды. Добейтесь воспроизводимого выхода толуола, а потом о чем-то можно говорить.
Если все выходит, добейтесь его удерживания в рамках 8-12 минут (250х4.6, 1 кубик) регулированием доли ацетонитрила. Зная эту долю, можно уже конвертировать методики с С18 на полимер.
4. 150 бар на 2 кубиках - это очень здорово. Это просто супер - несмотря на 70С. Да еще на таком жутком вязком элюенте. Значит, у колонки хорошая гидродинамика. Но не надо этим злоупотреблять. Полимерная колонка - это как жвачка. Разок ее придавить хорошенько - и обратно она не распрямится. Поэтому я бы не стал ее давить больше чем 150 бар. Как я уже говорил - выкиньте из элюента все спирты, только вода и ацетонитрил. Уменьшите скорость. Но и греть не надо. Не надо "плавить жвачку". Это слишком нежная штуковина.

Вот это для начала. Ну, завтра еще надо файл все-таки прицепить.

А по макролидам я в феврале где-то будут тестировать разные силикагельные фазы. Результаты будут в открытом доступе. Наверное, организуем ссылку в этого сайта тоже.

[Polina]

Спасибо, Константин.

Как говорится, беру Ваши слова и кладу себе в уши. И все же странно, одно дело - когда получается плохо и когда нет удерживания, а другое - когда наоборот, нет аналита. Я уже даже грешным делом подумала на детектор или кран дозатор, но убрав колонку и соединив пиик коннектором, ввела пробу и получила дивный пик всего этого компота (разумеется в самом начале хр-мы). Так что проблема не инструментальная.

[Константин Сычев]

Полина, раз чудес не бывает, то аналиты пока просто остаются в колонке. Надо их аккуратно оттуда вымыть. Кстати, замечание еще одно - для ПС-ДВБ средней степени сшивки (как у Вас) не рекомендуется слишком перебарщивать с долей менее полярного компонента элюента - может набухнуть. По моим ощущениям - это значит, что в элбенте всегда должна быть вода. То есть, если не помогает элюент ацетонитрил-вода 9-1 (это достаточно для элюирования толуола, например), то лучше перейти на элюенты типа ТГФ-вода, начав где-то с 1:1. ТОлько не спирты - они при этом сильно увеличивают вязкость - а увеличивать давление или греть ее как раз не надо из-за соображений нежности. И так же нельзя опускаться ниже определенной доли органики - фаза сожмется. По моим, опять же, ощущениям, это около 30% ацетонитрила. Вобщем, телодвижения весьма ограничены. А вот рН можно вообще любой делать, естественно. Да - и нельзя давать ей пересохнуть, после работы завинчивайте заглушки.

А что за колонка - это PRP-1? 5 микронник?

[Константин Сычев]

Но какие-то выводы я смогу делать только после воспроизведения пика толуола в привычной для себя системе..

[Иван Стыскин]

Да нет, колонка это Майшевская. Аналог колонки PLRP-S фирмы полимер лабораторис (вариан).
Сорбент Repromer RP-S 1000. По отмывке немцы порекомендовали ТГФ или Изопропанол.
Насчет пересыхания думаю для всех колонок актуально, а в целом достаточно стойкая
должна быть колонка, к ней думаю претензий нет.
Вопросы к методике...

[Константин Сычев]

Полина, вот смотрите:

1. The LC method developed used a RPC18 Lichrosphere column (125 × 2.1 mm, 3μm particle size) and a mobile phase of 0.05%
trifluoroacetic acid (TFA) / 0.05% formic acid (A) and 70% methanol / 30% acetonitrile (B). Macrolide elution employed a gradient from 60% A to 10% A in 10 min after an initial 2 min at 70% A; this allowed essentially baseline separation of all macrolides.

2. Column: Alltech Macrosphere™ 300 C4, 7μm, 250 x 4.6 mm. Mobile Phase: Acetonitrile:0.2M Ammonium Acetate in Water,
pH 4.5 (95:5) Flowrate: 1.0 mL/min

То есть, даже на С18 нужно процентов 80 ацетонитрила, чтобы эритромицин в приемлемое время вышел. Это значит, что с полимерной он не выйдет даже на 90-10 ацетонитрил-вода, даже несмотря на то, что колонка макропористая (у нее поверхность небольшая).

Что тут можно предпринять?

1. Обязательно увидьте пик толуола на 90-10 ацетонитрил-какой-то там буфер который используется по методике.
2. В той же системе все-таки кольните эритромицин. Температуру выставьте на 50. Все-таки включите для начала 2 мл/мин. Ждите ровно час.
3. Если его не дождались, или он выходит слишком поздно - переходите на ТГФ. Для начала 1:1 ТГФ-какой-то там буфер который используется по методике. Температура и скорость - те же. Сравните хроматограммы.

[Polina]

Добрый день.

Итак, первым пошла тестовая смесь (из того что в лабе было) фенол+толуол, в 85/15 ацетонитрил/вода. Условия: ПФ 85/15 ацетонитрил/вода, 1мл/мин, температура окружающей среды, 254нм УФ.
Толуол как-то криво ползет. Эффективность колонки составила: фенол - 7000, толуол - 2000 теор.тар. Коэффициент разделения составил 4.1 По производителю, чьи условия собственно были скопированы, эффективность по фенолу около 10000. Однако не указана концентрация.
При 50С - время удерживания толуола уменьшается на 1мин. На феноле практически не отразилось.

[Константин Сычев]

Так, понятно. Все пока путем. Теперь пункт 2! Вместо воды - буфер, ацн. - до 90%, т=50, скорость 2 - эритромицин

[Serga]

50мл фосфатный буферный раствор рН=9 + с 30мл MeCN + 165 мл трет-бутилового спирта на 1л смеси, водой до метки. 2мл в мин.

Откуда метОда? Нельзя ли получить ссылку на оригинал? (Первый раз вижу про припахивание трет-бутанола).

Концентрация "виновника торжества" 4мг/мл. Такой уж он...плохо поглощающий.

Какой практический смысл имеет определение эритромицина в таких лошадиных дозах? Где его можно так определять?

[Polina]

to Serga

Откуда метода - из Европейской Фармакопеи 6.0 том 2, вестимо.
Насчет концентрации - думаю, потому что не так-то просто увидеть все примеси, которые, как и их ближайший родственник, обладают весьма слабым хромофором. Вношу уточнение - это не в каких-либо биологических средах, это контроль качества субстанции, количественное определение и родственные примеси.
Забыла сказать, там еще и 100мкл надо вводить. Но у меня только 20 есть. Когда добьюсь чего-либо приемлемого, может, сооружу из пиика себе какое-либо подобие петли на 100.

[Polina]

Так, понятно. Все пока путем.

Эх, да как же путем, когда коэффициент хвостатости для толуола 2.4, а для фенола 1.3? Ожидала лучшего для таких простецких соединений на колонке с отсутствующими ионизированными группами.

[Константин Сычев]

Полина, Ваши ожидания построены на общении с обращенными фазами на основе силикагеля. Полимерные фазы обладают совершенно своими закономерностями. Во-первых, Вы обратили внимание, что удерживание фенола и толуола, особенно при повышении т-ры, вообще не отличаются - что немыслимо для С18 фазы? Во-вторых, Вы обратили внимание, что хвостит больше толуол - что нонсенс для С18 фаз - там однозначно если что и способно хвостить - это фенол. А это - МАКРОПОРИСТАЯ фаза на основе полистирола СРЕДНЕЙ степени сшивки. Чем крупнее и полярнее молекула, тем лучше должна быть кинетика - что опять же нонсенс для силикагельных жестких матриц с обычными порами типа 100А. И 7000 тарелок - это очень неплохо для 250мм колонки.

Все это потому, что Вы в голове пока не ту картинку нарисовали. Вы думаете - это сырные шарики с кучей сквозных дырочек. А это - куски мягкого хлеба, самого мякиша, а поры - пальцем просверленные в нем каналы. Теперь вообразите, что толуол не только по этим каналам бежит, но и в мякиш этот постоянно залипает.

А вообще - это все от того, что в фармакопее не печатают хроматограммы. И я их понимаю - им очень-очень стыдно.

[Константин Сычев]

Добавляю обещанное вложение - это моя работа для Purolite (UK) по разработке колонки на основе сверхсшитого полистирола. Предупреждаю - это материал, сходный с "обычным" полистиролом по химии, но значительно жестче сшивка - он значительно устойчивее к набуханию. Это значит, что много разделений - все, где нет воды в элюенте - нельзя вопроизводить на "обычных" полистирольных колонках - сдохнут. Но там, где вода в элюенте есть - сполне можно. И результаты, по идее, должны быть похожие.

[Polina]

Теперь пункт 2! Вместо воды - буфер, ацн. - до 90%, т=50, скорость 2 - эритромицин

Ну, что я могу рассказать вам про Сахалин. Вот картинка ,
номер раз - метанол(из растворенной пробы), холм№2 - аналит.
На 90% ацетонитрила с буфером 3.5г/л - вот полученная хроматограмма, чуть погодя дало о себе знать высаливание. Низкая доля "участия" фосфатного буфера в этом празднике жизни, а также вышеупомянутая проблема делают дальнейшие эксперименты с буфером бессмысленными, а то и похожими больше на ДИРФ. Уж не знаю, насколько корректно такое применение к полимерной фазе.
Попробую добавить в водную составляющую триэтиламина или даже тетраалкиламмониевую соль. Как-то сузить пик.

[Константин Сычев]

Ну, нормальный Сахалин. Дальше дело техники. Посчитайте эффективность по пику. Сначала уменьшите скорость до 1 кубика - это раз. Еще раз посчитайте эффективность. Уменьшите до 0.5. Еще раз посчитайте. Если последнее понижение скорости увеличивает эффективность % на 30 - работайте на 0.5. Если не все так очевидно, оставьте 1.

Самое заманчивое - это вместо этого дурного буфера использовать просто раствор аммиака (не надо никаких ТЭА, а тем более ТБА). Капнуть от души, что рН-метр зашкалило. Ведь среди примесей нет кислот? тогда все должно быть нормально. Тогда удеживание, конечно, прилично возрастет. У нас и так 8 минут на 1 кубике, а тут... попробуйте аккуратно поднять температуру.. ну, до 70, например. Если шумит - значит, кипит элюент, нужно небольшое противодавление на выходе. Если удерживание удалось загнать в предел 10 минут на 1 кубике - это вообще отлично. Еще раз считаем эффективность. Ну, можно еще скорость до 0.5 опустить. Вот и все вариации, вобщем-то.

Да, ксати, капилляр от инжектора к колонке внутри термостата? Какой он длины? Это тот случай, когда можно его сделать подлиннее, чтоб успело все прогреться.

И поставьте хотя бы вторую длину волны. Вообще 215 - это ни рыба ни мясо. Лучше поставить 205 и 230, например, или 205 и 254.. я люблю ставить 205 и 270 - получается один канал универсальный, и один на любую замещенную ароматику..

И никаго метанола на хроматограмме нет, я думаю.. заколите просто метанол - для чистоты эксперимента. Мне кажется, что все что мы видим - это образец.

[Serga]

И я их понимаю - им очень-очень стыдно.

Еще бы! Придумать полимерную колонку для эритромицина и вставить это в фармстатью- это надо постараться. Да и требования там к эффективности- практически никакие.
А пик- это, конечно, не метанол. А что-то из той же пробы.

[Иван Стыскин]

Нормальная картина, поскольку там PSDVB 8 микронный. рН заявлен от 1 до 14 у производителя
Длина волны кстати выбрана правильно 215 нм. Там после 6 минуты что то еще лезет?

[Константин Сычев]

Да, действительно - Вы подождали ровно час - как я просил? А то может, это не основное вещество даже.. оно где-то там впереди.. и это ОЧЕНЬ даже похоже на правду - наблюдаем два сопоставимых по площади пика в высотой на уровне 80 мАУ.. А основное небось в сто раз выше..

Я бы вообще сначала этот образец вот на этом же элюенте разок вколол на любой С18..

А волн при исследовании нужно ставить побольше!
Производитель, видимо, думает, что рН больше 14 не существует?

[Polina]

Ну как же не метанол, я бланк запустила (в чем растворяли пробу, представляющий собой фосфатный буфер 8.0/Метанол в соотн.3/. Чему же там еще поглощать на 215, как не ему? Вот, тот же пик (ужас, завалю тут все картинками, да простит меня модератор)

to Константин:
Насчет длины волны - у меня одна Честное слово.
Насчет капиляра - и вправду, довольно длинный, см.12. Все руки не доходили срезать.
Час ждала, ничего не было. Это собственно, был стандарт Эритромицина А, так что там и должен быть один пик.
Поскольку в определенный момент все же произошло расслоение элюента из-за высаливания, буфер разбавила и завтра добавлю к картине еще Эритромицин B и Эритромицин С.
Насчет С18 - я уже подготовила достойную "камикадзе".
Константин, обязательно сделаю аммиачную ПФ. Это что-то!
Спасибо за внимание к проблеме и ценные советы.

[Serga]

Ну как же не метанол, я бланк запустила (в чем растворяли пробу, представляющий собой фосфатный буфер 8.0/Метанол в соотн.3/. Чему же там еще поглощать на 215, как не ему?

Да никакой это не метанол. Метанол даст скорее обратный пик на фоне фосфатного буфера.
Метанол не поглощает при 215, и при 200 почти не поглощает. А уж с этой колонки смыть чего- не вопрос. Что раньше загоняли- то и получИте. Да и полимер может грязи добавлять.
Потом, образец лучше растворять в элюенте, а не в каком-то левом буфере с метанолом.

[Константин Сычев]

Да, Полина, с постом согласен. Может быть, метанол что-то вытесняет.. Метанол на 215 действительно дал бы пик в обратную сторону.. Действительно, лучше растворить образец в ацетонитриле, который применялся для приготовления элюента.

И действительно - я совсем забыл, что буфер на основе неорганической соли. Конечно, никакую неорганическую соль здесь использовать нельзя в принципе. Либо просто ацетонитрил-вода, либо сразу аммиаком загонять в щелочную среду до предела.

Поскольку система была неустойчивой, то на ту картинку пока вообще не стоит сильно обращать внимания. Может, и широкий пик, и непонятный пик вначале - это артефакты вот этой неустойчивой системы с расслаивающейся фазой. Полина, никакого ДИРФа здесь не выйдет - это НЕ силикагель.. там нет такой вот поверхности, которую можно было бы модифицировать.. там - полимерная сетка, причем довольно мягкая..

Жаль, что детектор не сканирующий.. ладно, финальную хроматограмму (если до нее доберемся) придет снять несколько раз на разных длинах волн - для надежности.

[Serga]

А почему именно на полимере надо делать эритромицин? Чем обычная колонка с привитым С18 на силикагеле хуже? Ни тебе проблем с набуханием-усадкой, ни тебе расширения, ни прочих загадок удерживания. Разве в нашей ГФ что-то на этот счет запрещается? Если вы на ней даже одной формы толком не видите, какой смысл городить огород? КонстантинС дал же вполне нормальные метОды. Их и надо пробовать в первую очередь. А потом уж тренироваться на полимере.

[Константин Сычев]

Эта статья как-то в фармакопею попала - с этого и началось.. мы все честно кричали, что не надо этого делать..

[Alexander_V]

Здравствуйте!
Интересуют особенности использования полистирол-дивинилбензольных колонок для масс-спектрометрического детектирования. Зачастую фазы при таком детектировании содержат большое количество воды, и со временем, хоть и весьма долгим, приводят к гидролизу алкильных групп на кремнии. Полимерная колонка такого недостатка лишена, но какова высота теоретической тарелки, как удерживаются аналиты?
Конкретная задача на сегодняшний момент: анализ антибиотиков по ГОСТ 54904—2012. Согласно ГОСТу нужна колонка хроматографическая обращённо-фазовая длиной не менее 150 мм с размером диаметра частиц сорбента не более 3,5 мкм. Подвижная фаза: А — вода, B — метанол, режим градиентный, от 75–90% воды к 100% метанола и затем возврат к начальному соотношению. Скорость потока 0,2 мл/мин.
Другие планируемые соединения это некоторые пестициды, может витамины, то есть органические вещества с полярными группами, в том числе карбоксильными и аминовыми — что хорошо детектируется при APCI.
Буду благодарен за советы.

[Константин Сычев]

Добрый день, Александр! Иметь дело с полистиролом очень не советую. Оставьте его в покое. Метанол поменяйте на ацетонитрил, давление упадет в среднем в 3 раза, соответственно, в 3 раза уменьшится время анализа.
Я бы посоветовал просто хорошую С18 колонку, химически инертную и с повышенной долей углерода (там требуются бОльшие доли органического растворителя, соответственно, будет выше у МС чувствительность).
Лично я гарантирую качество колонок под нашей торговой маркой NanoSpher. Они проверялись по пику кодеина с неоптимальных условиях (асимметрия не больше 1.2 и падение эффективности относительно паспортной не более 50%). Мы их продаем как колонки премиум-класса, с индивидуальным тестом.
Вам подойдет вот такая, или лучше такая же, но размера 150х2.1 с 3 мкм (и предколонку еще) viewtopic.php?f=53&t=845

[Alexander_V]

Спасибо за информацию! Предложение на поставку колонки передам руководителю.