Водорастворимые витамины на ВЭЖХ Agilent 1200

[FeroxDS]

Доброго времени суток колеги. Задавал свой вопрос на других форумах, но ответ пока не получил,
может здесь мне помогут.
Не так давно у нас сократился штат, и меня отправили в лабораторию химического анализа осваивать ВЭЖХ. Сейчас основной задачей является определение водорастворимых витаминов В1, В2, В3, В5 (пантотенат Са), В6 и фолиевой кислоты. Прочитав множества разных методик, остановился на одной из них, результаты получаю, но они какие-то не однозначные. Стандартные растворы дают нужные пики, стабильность и повторяемость присутствует, но когда прокалываю образцы пики во первых смещаются, а во вторых результаты сильно пляшут, как в меньшую так и в большую сторону.
Очень хотел бы получить от вас помощи или совета. Ниже методика, по которой я работаю.
ВЭЖХ agilent 1200 с VWD и FLD детекторами, Колонка Zorbax SB-C18 4,6х150мм 3,5мкм
Подвижная фаза А – ACN
Пподвижная фаза В – Н2О Рh 3,0 доведенная H2SO4(по методике 2,0, но я побоялся испортить колонку поэтому ставлю 3,0)
Стандартные растворы витаминов готовлю из расчета 50мг на 50мл. Так чтобы концентрация была 1мг на 1 мл. Для каждого витамина отдельно
Рабочий стандартный раствор: 20мкл Стандартного раствора (каждого из шести витаминов) + 880мкл HCl 0,1М. Таким образом стандарт для прокола содержит по 20мкг каждого из витаминов.
Характеристики вкола: Вкол 20мкл; поток 1,5 мл; градиент 0-3мин 2%А + 98%В, 3,5-10мин 20%А + 80%В (градиент подбирал эмпирически); длина волны VWD - В1, В3 - 244нм, В2, ФК - 262нм, В6-292нм, В5 (пантотеновая к-та) 200нм.
Делаю в среднем 5 проколов стандарта для насыщения колонки, и пока выходящие пики не станут стабильными, после чего запускаю образцы для исследования.
Вот тут и начинаются проблемы, методы для извлечения витаминов для разных групп продуктов разные (молочные, премиксы, бады и т.д.). Пытался делать и по Скурихину и по ГОСТам и по другим методикам и всегда результаты разные. Остановился на одной методике: 1г продукта + 10мл HCl 0,1М, все это гомогенизирую, растворяю (по мере возможности), помещаю в пробирку с прикручивающийся крышкой, и ставлю при 65С на твердотельный термостат 10мин. Затем на УЗ Баню 15 мин, после чего фильтрую, ц-фугирую при 8тыс обор/10мин., отбираю 200мкл фильтрата и довожу до 1мл 0,1М HCl . Собственно, это и вкалываю. При получении результатов количество некоторых витаминов может сильно отличаться как в большую, так и в меньшую стороны.
Подскажите, где я допускаю ошибку?
Заранее благодарю! С уважением.

[Константин Сычев]

Добрый день!
Ошибки в подготовке пробы вроде нет. Кипятите разве что подольше, и даже в самой сложной матрице они рано или поздно растворятся. Ну, в кислой среде никотиамид до никотинки чуть повалится, а так все остальные должны это пережить.
Есть у Вас небольшое непонимание уровня сложности задачи именно в плане хроматографии.
Дело в том, что групповое определение в ВЭЖХ стандартными методами в сложных матрицах - это вообще нетривиальная задача. Когда матрица сложная, то как правило:
- все делают в изократическом режиме, настраивая...
- ... разделение на одно вещество, причем...
- ... по возможности используя две дублирующие системы в разных ВЭЖХ режимах.
Т.е. то, на что Вы замахнулись - это высший пилотаж. Если он получается))) но в реальности такие методики не применяют, потому что методика прежде всего должна быть воспроизводима в любых условиях.

У нас, кстати, наборы на ВЭЖХ витамины есть. Вот можно посмотреть здесь: viewforum.php?f=47
Тут об анализаторе, но мы продаем и наборы для определения на любом приборе. НО! опять же, эти методики настроены на быстрый групповой анализ витаминных препаратов, т.е. на самые легкие матрицы. С учетом сложных матриц их нужно немного адаптировать.

А какие вещества не получаются - я, наверное, угадаю))) не получаться должны В1 и В5.
В1 - потому что тиамин просто не удерживается в приведенной системе. Т.е. в приведенных условия В1 вообще нельзя определять.
В5 - потому что неселективная длина волны, низкое поглощение. Любая фитюлька из матрицы легко "накроет" этот пик с головой - не говоря уже о точной количественном определении.

Т.е. погрешность - скорее в хроматографии, а не в пробоподготовке. Задача значительно сложнее, чем Вы могли предполагать. Сначала нужно отладить надежное ВЭЖХ разделение (например, на одном реальном образце с добавками). И уже потом переходить на игры с пробоподготовкой.

[Клим]

В случае разделения витаминов группы В (и фолиевой кислоты в том числе) может помочь ион-парная хроматография.
Элюент А - 0,94 г гептилсульфоната натрия, 2,7 г дигидрофосфата калия, 1,25 мл уксусной кислоты, 25 мкл триэтиламина (расчет на 500 мл)
Элюент Б - вода + ацетонитрил (1:1)
Режим элюирования: 0-3,5 мин - 5%В, 3,5-15 мин прямой градиент 5-95%В.
Анализ проводился на приборе Милихром-А02 (колонка ProntoSIL 75 мм), в Вашем случае думаю стоит пересмотреть режим элюирования.
Применяли данную методику для разделения янтарной кислоты, никотинамида и рибофлавина, все прекрасно пошло, идеальная воспроизводимость.
А...да... и обязательно (!) перед анализом промыть колонку фазой А 10-кратным объемом колонки.

[Константин Сычев]

Клим, извините, но не могу не вмешаться. В применяемой системе допущено сразу несколько ошибок. Вы добились разделения трех пиков на требуемом уровне концентраций на одной колонке. Но это не значит, что кто-то другой это воспроизведет у себя.
Во-первых, Вы даже толком не зашли в ион-парный режим. Гептил-сульфонат - это очень слабый реагент. Он просто смывается сильной ступенью градиента, т.е. никакого ион-парного режима просто не получается.
Во-вторых, градиентный режим не сочетается с применением добавок, поглощающих в УФ области. А тут все поглощает: и триэтиламин, и кислота... Чтобы хоть что-то увидеть в такой системе, концентрации нужны (особенно янтарной кислоты) просто ломовые.
В-третьих, для разделения этих трех пиков вообще не нужны никакие добавки кроме буфера. Янтарная и В3 выходят просто на подкисленной подсоленной воде, а В2 домывается легким градиентом. Если для буфера применять фосфаты, то зачем туда заливать уксусную кислоту? Подкислите фосфорной... А триэтиламин тут вообще ни при чем...

[Клим]

Здравствуйте, Константин!
В Вашей книге "Практический курс жидкостной хроматографии" 2013 года на странице 41 написано, что алкилсульфонаты - хорошие ион-парные реагенты. Как понимать Вашу фразу "Вы даже толком не зашли в ион-парный режим"???
Что касается градиентного элюирования.... В начале анализа у нас была ступенька изократики с 5% ацетонитрила для удерживания янтарной кислоты и для того чтобы не смыть модификатор, витамины же группы В при таком раскладе вышли бы либо очень поздно, либо размытыми пиками. Именно поэтому далее начинали градиентное элюирование.
Содержание янтарной кислоты в нашем препарате исчисляется милиграммами, а не нанограммами, поэтому с учетом ее плохого поглощения и/или поглощения примесей (из кислоты, триэтиламин) она в любом случае детектируется.
Чтобы увидеть посторонние примеси из подвижной фазы, различных модификаторов и т.д. проводим так называемый холостой анализ, на хроматограмме подвижной фазы можно исключить таковые примеси.
Просто на подкисленном буфере проводили анализ, янтарная кислота не удерживалась, вылетала в мертвом объеме.
На счет уксусной кислоты.... Заметьте! Я не упоминал слово буфер. Раствор дигидрофосфата калия подкисленный уксусной кислотой. А какой кислотой что подкислять - дело выбора аналитика.
Конечно же важен сорбент, данный анализ получился на ProntoSIL AQ (Милихром-А02), на Supelco (Shimadzu LC-20) не пошел.

С уважением, Леонов Клим.