Начнем с «физико-химического анализа». Ключевое слово здесь – «анализ», что в переводе с греческого обозначает «разделение». Другими словами, анализ проводится с целью что-то разобрать и выяснить, что из чего состоит. Нас интересует конкретно анализ вещества, причем вещество может быть каким угодно. К примеру, сладким чаем. Здесь сладкий чай – это объект анализа.
Допустим, на столе стоит стакан с жидкостью. На стакане написано «№ 043». Это образец номер 043, или проба номер 043 (на английском оба термина обозначаются словом sample). Посмотрим на жидкость – она коричневая. На запах – пахнет чаем. Возьмем стакан и немного взболтаем жидкость. По плотности и вязкости можно предположить, что основа жидкости – вода. Попробуем жидкость на вкус и окончательно убедимся, что основа жидкости – действительно вода. Также мы почувствуем, что жидкость сладкая и имеет вкус чая. Вывод: в стакане налит сладкий чай.
Только что мы провели простейший анализ вещества и установили что оно из себя представляет, то есть мы его идентифицировали. Это удалось сделать благодаря тому, что мы изучили его физические и химические свойства. Поэтому этот анализ с полным правом можно назвать физико-химическим. По отдельным свойствам мы сначала догадались, какие именно составляющие компоненты присутствуют в жидкости. А уже по списку составляющих компонентов догадались (сделали заключение) о том, чем является эта жидкость.
В этом случае, однако, мы не разделяли компоненты фактически. Мы всего лишь подмечали индивидуальные свойства каждого из компонентов, исследуя их смесь. Но можно сделать все иначе. К примеру, методами перегонки, экстракции и осаждения действительно разделить сладкий чай на составляющие его воду, сахар и «заварку». Это будет гораздо сложнее, но зато надежнее и информативнее. Мы будем иметь не косвенные, а прямые доказательства своей правоты – выделенные в чистом виде компоненты, которые раньше находились в смеси.
По такому принципу, в частности, работает и хроматографический метод. В этом физико-химическом методе вещество также разделяется на составляющие компоненты, но не за счет перегонки, экстракции, или осаждения. Хроматография основана на явлении распределения вещества между двумя несмешивающимися фазами. В том случае, когда одна из фаз является твердым веществом, то процесс распределения называют адсорбцией (adsorption).
Адсорбция – это процесс преимущественного концентрирования вещества твердой фазой, которую в этом случае называют адсорбентом (adsorbent). Разные химические вещества концентрируются адсорбентами в разной степени, что и положено в основу их разделения.
Для иллюстрации адсорбции можно провести очень простой опыт. Для этого нужно пропустить крепкий сладкий чай через любой бытовой фильтр для очистки воды со свежей кассетой. Раствор, прошедший через фильтр (фильтрат), будет почти бесцветным, но не менее сладким, чем исходный чай. Все дело в том, что кассета бытового фильтра заполнена смесью двух адсорбентов: активированного угля и ионообменного пористого полимера. Они достаточно эффективно адсорбируют из воды пигменты (красители) чая, а вот удалить из воды сахар им не по силам. Так что условно можно считать, что нам удалось адсорбционно разделить сладкий чай на сладкую воду и «заварку».
Только что мы провели типичный эксперимент по твердофазной экстракции (solid-phase extraction), или сокращенно ТФЭ (SPE). Как правило, ТФЭ применяется не для анализа непосредственно, а для предварительной очиcтки (sample clean-up) или концентрирования компонентов образца перед анализом, то есть для подготовки пробы (sample preparation). Кассета с адсорбентом в случае ТФЭ называется адсорбционным картриджем (cartridge).
Но, разумеется, разделить все компоненты смеси таким образом нельзя, поскольку на картридж постоянно подается раствор со смесью веществ. Провести полное разделение становится возможным, если через слой адсорбента с нанесенной смесью веществ пропускать чистый растворитель. Такой вариант адсорбционного разделения представляет собой один из подвидов хроматографии (chromatography). В хроматографии кассету с адсорбентом принято называть хроматографической колонкой (column), а наполняющий ее адсорбент (packing) неподвижной фазой (stationary phase). Чистый растворитель или смесь растворителей, которые пропускаются через колонку, называют элюентом или подвижной фазой (mobile phase). Сам процесс пропускания элюента через хроматографическую колонку называется элюированием (elution).
Чтобы все стало понятно, предлагаю провести небольшой мысленный эксперимент по хроматографическому разделению. К примеру, нам надо полностью разделить смесь трех красителей: зеленого, синего и красного. Разумеется, смесь этих красителей – черного цвета. Пусть у нас будет в распоряжении хроматографическая колонка из стекла (чтобы было можно наблюдать за разделением) с подходящим адсорбентом и подходящая смесь растворителей, то есть элюент.
Аккуратно нанесем часть образца (пробу) в верхнюю часть хроматографической колонки и начнем пропускать через колонку приготовленный элюент (см. рис. 1). Если адсорбент не очень мелкий, с зернением не менее 100 микрометров (100 мкм = 0.1 мм), то элюент будет проходить через слой адсорбента просто под собственной тяжестью. Таким образом, мы пока избежим необходимости насосной системы (pump).
Мы будем наблюдать как за колонкой, так и за вытекающим из хроматографической колонки фильтратом, который называется элюатом. Причем попытаемся сделать наше наблюдение если не количественным, то хотя бы полуколичественным. Используя зрение как детектор (detector), мы будем строить график насыщенности цвета капель элюата от времени с момента начала анализа.
Итак, анализ начинается в момент подачи элюента (см. рис. 1а). Через некоторое время t1 (см. рис. 1б) мы наблюдаем следующую картину: проба разделилась в колонке на три хроматографических зоны – зеленую, синюю и красную – по числу компонентов в образце. Это значит, что смесь красителей разделилась полностью. Ближе к началу колонки (то есть в ее верхней части) находится зона зеленого красителя, в середине – зона синего красителя, и уже в самом конце колонки – зона красного красителя. Такая картина наблюдается потому, что зеленый краситель адсорбируется сильнее всего (говорят, что он сильнее всего удерживается адсорбентом), в результате чего его хроматографическая зона передвигается вдоль колонки с наименьшей скоростью. Красный же краситель слабо удерживается адсорбентом, поэтому он выходит из колонки (элюируется) первым.
Факт элюирования красного красителя с колонки следует надлежащим образом зафиксировать на графике. Сначала мы увидим, что цвет первых капель очень слабый. Он будет нарастать, и в какой-то момент насыщенность цвета будет максимальной. Затем цвет капель опять пойдет на убыль. В результате, сигнал от красного компонента образца на графике будет иметь форму колокола. Такой сигнал называется пиком (peak). Время, соответствующее максимуму пика красного красителя, будет называться временем удерживания (retention time) красного красителя.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматографическое разделение смеси трех красителей. www.chromforum.ru
Рисунок 1. Хроматографическое разделение смеси трех красителей
К некоторому моменту времени t2 (см. рис. 1в) красный и синий красители уже вышли из колонки, а зеленый только начинает выходить. На графике, соответственно, видны два пика – и третий только начинает прописываться. График с пиками называется хроматограммой (chromatogram). Хроматограмма является основным результатом хроматографического анализа.
Как показывает практика, в большинстве случаев совсем необязательно разделять все компоненты сложной смеси, число которых может достигать сотен и тысяч. Достаточно выделить из исследуемого вещества лишь интересующие нас компоненты. Такие компоненты называют аналитами (analyts) или целевыми соединениями, а сам анализ конкретных компонентов – определением. Допустим, в приведенном выше примере нас интересовало определение только зеленого красителя. Тогда было бы совершенно неважно, разделились ли красный краситель от синего – главное, чтобы пик зеленого красителя хорошо отделился от всех остальных. Таким образом, все компоненты, которые элюируются рядом с целевыми соединениями и могут помешать правильному определению, называются мешающими соединениями (contaminants). Если в образце присутствует множество мешающих соединений, то либо от них надо избавляться на стадии очистки пробы, либо подбирать такие условия разделения и детектирования, чтобы гарантировать достаточное разрешение пика целевого вещества от других пиков на хроматограмме.
Определение целевого вещества может быть качественным и количественным. Результаты качественного определения, или идентификации (identification), отвечают на вопрос – «есть ли целевое соединение в образце или нет?» (на пределе обнаружения для данного метода анализа). Для хроматографии этот вопрос можно перефразировать так: «есть ли пик целевого соединения на хроматограмме или нет?».
Результаты количественного определения (quantification) отвечают на вопрос – «какое количество целевого соединения находится в данном количестве образца?» (другими словами, «какова концентрация целевого соединения в образце?»). В хроматографии концентрация вещества в пробе тем больше, чем больше площадь, ограниченная пиком этого вещества на хроматограмме. Другими словами, концентрация вещества в пробе пропорциональна площади пика (peak area) этого вещества.
Вообще, время удерживания и площадь пика являются одними из основных параметров пика. По времени удерживания соединения в выбранных условиях проводят идентификацию этого соединения, то есть качественный анализ. Когда соединение идентифицировано, знание площади пика необходимо уже для количественного анализа.
Кроме того, в зависимости от типа применяемого детектора у пика может быть индивидуальные спектральные характеристики, которые значительно облегчают идентификацию соединений и делают ее значительно более надежной.
Вернемся к примеру с разделением трех красителей. Допустим, необходимо доказать отсутствие в пробе токсичного красного красителя амаранта, который в выбранных условиях должен элюироваться в начале хроматограммы. Мы видим, что на хроматограмме действительно есть пик красного красителя, причем время удерживания очень похоже на ожидаемое для амаранта. Однако всегда есть вероятность, что это пик не амаранта, а другого, неизвестного красного красителя (а их существуют десятки) с практически совпадающим временем удерживания. Выйти из затруднения можно, применяя в качестве детектора не зрение, а спектрофотометр – прибор, позволяющий измерить для соединения его спектр поглощения, к примеру, в видимой области. Сравнив известный спектр амаранта и полученный спектр неизвестного красного красителя, можно выяснить, действительно ли последний является амарантом, или нет.
Все параметры пика: время удерживания, спектральные характеристики, площадь пика – неразрывно связаны с условиями, в которых получена хроматограмма. Их можно формально разделить на условия разделения и условия детектирования. Все условия разделения в совокупности: тип адсорбента, габариты хроматографической колонки, состав элюента, скорость потока (flow rate), температура – называются хроматографическими параметрами разделения.
1.1.2. Жидкостная хроматография низкого и высокого давления. Схема жидкостного хроматографа высокого давления
Приведенный пример с разделением красителей относится к жидкостной хроматографии (liquid chromatography, LC), где подвижной фазой является жидкость. Исторически все основные закономерности хроматографии были исследованы именно на примере жидкостной хроматографии. Эту работу провел российский ученый Михаил Семенович Цвет в начале двадцатого века. Однако, серьезное развитие хроматографических методов последовало лишь в середине прошлого века благодаря работам американских и английских ученых в области газовой хроматографии (gas chromatography, GC). Подвижной фазой в газовой хроматографии служит инертный газ: азот, гелий или водород.
Первые установки для проведения экспериментов по жидкостной хроматографии были очень простыми; фактически, они состояли из одной хроматографической колонки. Поскольку в то время были доступны только адсорбенты с достаточно крупными частицами, элюент мог свободно проходить через слой адсорбента под собственной тяжестью. Таким образом, необходимость использования насоса для подачи элюента под значительным давлением отсутствовала. Поскольку первые эксперименты по разделению проводились на образцах смесей натуральных пигментов (красителей), видимых глазом, то в этом случае можно было обойтись без детектора.
Описанные устройства относятся к хроматографическим системам низкого давления (low pressure liquid chromatography, LPLC). Разумеется, современные специализированные системы жидкостной хроматографии под низким давлением могут представлять собой сложные и дорогостоящие приборы. Но их объединяет использование адсорбентов с достаточно крупными частицами, в результате чего давление в таких системах не превышает нескольких атмосфер.
Техника проведения эксперимента по разделению при низком давлении достаточно проста. Можно сказать, что она уже была частично описана в предыдущей главе.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Колонки для хроматографии низкого и высокого давления, а также вид типичных хроматограмм, получаемых на подобных установках: а – колонка для разделения при низком давлении, б – колонка для разделения при высоком давлении, в – типичная хроматограмма разделения трехкомпонентной смеси при низком давлении, г – типичная хроматограмма разделения трехкомпонентной смеси при высоком давлении. www.chromforum.ru
Рисунок 2. Колонки для хроматографии низкого и высокого давления, а также вид типичных хроматограмм, получаемых на подобных установках: а – колонка для разделения при низком давлении, б – колонка для разделения при высоком давлении, в – типичная хроматограмма разделения трехкомпонентной смеси при низком давлении, г – типичная хроматограмма разделения трехкомпонентной смеси при высоком давлении
Сначала берут специальную стеклянную трубку (вообще говоря, она называется колонкой, как ни странно) длиной около 20 см и диаметром 1-2 см с пористым стеклянным фильтром на дне и сужающимся горлышком (см. рис. 2а). Закрепляют ее на штативе в вертикальном положении. Аккуратно переносят в колонку 5-8 см адсорбционного материала – пористого порошка с зернением (средним диаметром частиц) порядка 100 микрометров, то есть 0.1 мм. Колонка готова.
Обычно на такую колонку пробу не наносят в жидком состоянии – поступают несколько иначе. Жидкую пробу смешивают с адсорбентом и с минимальным нагреванием отгоняют растворитель. Высушенный адсорбент с нанесенной пробой переносят в колонку и тонким слоем (0.1-0.5 см) распределяют поверх слоя адсорбента. Смешиванием растворителей готовят необходимый объем элюента. И, наконец, проводят элюирование, время от времени добавляя элюент через верхнюю открытую часть колонки. Фракции элюата отбирают в пронумерованные градуированные стаканчики или колбы. Хроматограмму можно построить, измеряя какое-либо свойство каждой из фракций: поглощение света в видимом или ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, показатель преломления света, электропроводность (если разделяется смесь ионных соединений), активность (если разделяется смесь ферментов), радиоактивность (если разделяются меченные радиоактивными изотопами соединения) и так далее. Все перечисленные методы относятся к методам детектирования. Величина измеряемого свойства откладывается по оси у, номер фракции – по оси х.
Системы низкого давления позволяют работать с большими объемами адсорбента, что является необходимым условием для хроматографического выделения больших количеств целевых веществ высокой чистоты. Хроматография, целью которой является не анализ, а выделение чистых веществ из содержащих их субстанций, называется препаративной хроматографией (preparative chromatography). Колонки для промышленных установок препаративной хроматографии могут достигать 0.5-3 метров (!) в диаметре и длины в несколько метров.
Но для целей аналитической химии хроматография низкого давления непригодна. У нее есть существенный недостаток: сравнительно низкая разрешающая способность. Это значит, что хроматографические зоны компонентов получаются очень широкими, и для полного разделения компонентов требуется очень большое различие во времени удерживания. Что на практике, вообще говоря, встречается совсем нечасто. Пример разделения, типичного для хроматографии низкого давления, приведен на рисунке 2в. Очевидно, что в этом варианте сложно достичь очень хорошего разделения. Кроме того, для элюирования компонентов требуется значительное время.
Основная причина невысокой разрешающей способности заключена в применении адсорбентов с крупными частицами. Для того, чтобы жидкостная хроматография могла выполнять задачи аналитической химии, необходимо уменьшить средний диаметр частиц адсорбента по крайней мере до 10 микрометров, то есть до 0.01 мм. Подобные адсорбционные материалы стали широко доступны только в начале 70-х годов прошлого века. Переход на новые мелкозернистые адсорбенты повлек за собой революционные изменения в технике для проведения разделений методом жидкостной хроматографии.
Для того, чтобы жидкость (элюент) могла пройти через трубку длиной 15-25 см, плотно упакованную мелким порошком со средним размером частиц 3-5 микрометров (то есть колонку для аналитической хроматографии), необходимо создать значительное давление порядка 100-200 атмосфер. Создать такое давление можно лишь при помощи специального и притом достаточно дорогостоящего насоса высокого давления. Жидкостная хроматография высокого давления получила название высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ (high performance liquid chromatography, HPLC). ВЭЖХ широко применяется как один из наиболее универсальных методов физико-химического анализа вещества.
Колонка для ВЭЖХ, заполненная определенным адсорбентом, является, по сути, промышленно выпускаемым изделием. Она представляет собой стальную (как правило) трубку длиной от 5 см до 25 см и внутренним диаметром от 2 мм до 4.6 мм, которая заполнена адсорбентом определенной марки. Колонка симметрична; с каждой стороны на нее устанавливают пористый фильтр из губчатого титана и съемную (как правило) уплотнительную гайку. Циркулирующая жидкость подводится к колонке и отводится от нее по пластиковым капиллярам, которые закрепляются на концах колонки при помощи специальных уплотнительных винтов – фитингов (см. рис. 2б). Типичная для ВЭЖХ хроматограмма приведена на рисунке 2г. На современных аналитических колонках для жидкостной хроматографии можно полностью разделить до двух-трех десятков компонентов за 10-15 минут.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема устройства жидкостного хроматографа: 1 – емкость для отбора элюента, 2 – насосная система, 3 – система инжектирования (ввода пробы), 4 – хроматографическая колонка, 5 – система детектирования, 6 – емкость для слива элюата. www.chromforum.ru
Рисунок 3. Схема устройства жидкостного хроматографа: 1 – емкость для отбора элюента, 2 – насосная система, 3 – система инжектирования (ввода пробы), 4 – хроматографическая колонка, 5 – система детектирования, 6 – емкость для слива элюата
Но за все хорошее, как известно, надо платить: для проведения аналитического разделения методом ВЭЖХ одной колонки уже недостаточно – необходим целый прибор, который называется жидкостным хроматографом (liquid chromatograph).
Схема самого простого варианта жидкостного хроматографа приведена на рисунке 3. Как мы уже выяснили, для работы с высокоэффективными колонками нужен насос высокого давления. Кроме того, для ввода (инжектирования) пробы под давлением также необходимо специальное устройство, которое называется инжектором (injector). Наконец, аналитический прибор не может обойтись без высокочувствительного детектора (detector). Задача детектора состоит в том, чтобы «замечать» самые различные вещества, выходящие из хроматографической колонки, даже в очень низкой концентрации.
1.1.3. Способы улучшения разделения
Возможности хроматографии как метода анализа вещества очень сильно зависят от ее способности обеспечивать как можно лучшее разделение сложных смесей на индивидуальные компоненты. От этого зависит правильность анализа, или даже вообще возможность проведения определения.
Также немаловажно и время анализа – никому не нужен метод, требующий несколько часов на простейшее аналитическое определение. Одним словом, каждый хроматографист мечтает (но только в рабочее время) как бы разделить свои образцы получше и поскорее. Процесс улучшения методик разделения называется оптимизацией разделения. В этой главе мы начнем обсуждение вопросов оптимизации, а заодно пополним лексикон недостающими терминами.
Двигаться будем постепенно, так что советую запастись терпением. Сначала подведем итоги предыдущих глав. Итак, графическим представлением результата разделения является хроматограмма – зависимость сигнала детектора от времени элюирования. Хроматограмма начинается в момент ввода пробы и может быть остановлена, в принципе, в любой момент.
Каждое вещество, регистрируемое детектором, отображается на хроматограмме в виде пика – зависимости концентрации этого вещества в элюате от времени элюирования. Площадь пика пропорциональна концентрации вещества в пробе; коэффициент пропорциональности зависит как от самого вещества, так и от типа применяемого детектора.
Основной характеристикой вещества в данной хроматографической системе является его удерживание в хроматографической колонке, которое может быть выражено несколькими величинами.
Непосредственно из хроматограммы, по положению максимума пика вещества, определяется его время удерживания tR. Объем удерживания (retention volume) VR равен произведению времени удерживания на объемную скорость подачи подвижной фазы: VR = tR*v.
1.1.3.1. Удерживание. Разрешение
Теперь, если здесь все ясно, будем двигаться дальше. Представьте, что в пробе есть вещество, которое совсем не адсорбируется, то есть совсем не удерживается в выбранных условиях. Оно, надо сказать, не выйдет из колонки сразу в момент старта анализа. Ему надо, пусть даже не задерживаясь, пройти через колонку вместе с элюентом, на что нужно определенное время.
Это время называется нулевым (мертвым). Итак, нулевым временем t0 называется время, затрачиваемое полностью несорбируемым веществом на прохождение по хроматографической колонке от узла ввода пробы до кюветы детектора. Нулевое время определяется экспериментально инжектированием в колонку заведомо неудерживаемого компонента. Нулевой объем V0 при условии пренебрежимо малого объема подводящих капилляров равен объему подвижной фазы внутри хроматографической колонки, то есть около 70% ее общего объема VС. Нулевой объем определяется как произведение нулевого времени на объемную скорость подачи элюента V0 = t0*v.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Параметры хроматографических пиков:
t0 – нулевое время;
tR [1] – время удерживания для первого пика;
t’R [1] – исправленное время удерживания для первого пика;
w [1] – ширина первого пика у основания;
w1/2 [2] – ширина второго пика на половине его высоты. www.chromforum.ru
Рисунок 4. Параметры хроматографических пиков:
t0 – нулевое время;
tR [1] – время удерживания для первого пика;
t’R [1] – исправленное время удерживания для первого пика;
w [1] – ширина первого пика у основания;
w1/2 [2] – ширина второго пика на половине его высоты
Приведенным временем удерживания t’R называется разница между временем удерживания вещества и нулевым временем t’R = tR - t0 (см. рис. 4).
Фактором удерживания (retention factor), или в старой номенклатуре фактором емкости (capacity factor), k’ называется отношение приведенного времени удерживания вещества к нулевому времени k’ = t’R/t0.
Зачем нужны такие сложности? Не проще было бы просто ограничиться одним параметром пика – временем удерживания?
Все дело в том, что время удерживания tR – это величина, которая измеряется в секундах (минутах, часах), и она строго привязана к габаритам хроматографической колонки и объемной скорости подачи подвижной фазы. Фактор емкости k’ никак он них не зависит. Эта безразмерная величина является мерой удерживания данного вещества на данном адсорбенте при применении данного элюента. И если для целей аналитической химии нам будет вполне достаточно знать tR, то для сравнения разных результатов на разных колонках мы будем пользоваться исключительно величинами k’.
Удобство фактора емкости для научных исследований заключается в том, что k’ с точностью до постоянного для каждой хроматографической колонки множителя равен константе адсорбции вещества в хроматографической системе (строго говоря, при условии предельно низкой концентрации вещества в пробе, в области линейности изотермы адсорбции):
K = (V0/(VС – V0))*k’,
К – константа адсорбции вещества в хроматографической системе,
k’ – фактор емкости пика,
VС – общий объем колонки,
V0 – нулевой объем.
Для современных аналитических колонок размера 250х4.6 (длиной 250 мм и внутренним диаметром 4.6 мм) при скорости подачи элюента 2 мл/мин нулевое время составляет величину порядка t0 ≈ 1.3 мин., а оптимальное время элюирования целевого соединения 2 < k’ < 4 изменяется от 4 до 7 мин.
Задачей хроматографии является разделение веществ за счет разности в их удерживании. Степень разделения двух веществ называется разрешением (resolution).
Термин «разрешение» необходим для того, чтобы выразить степень разделения двух пиков количественно. Непосредственно из хроматограммы разрешение двух пиков вычисляется как отношение разницы во временах удерживания к половине суммы ширин пиков на уровне базовой линии:
R = 2*(tR1 – tR2)/(w1 + w2).
Если вещества не разделяются, то разрешение равно нулю. При разрешении, равном единице, перекрываются лишь около 2% площадей двух пиков – при условии, что пики идеально симметричные, имеющие форму Гауссовой кривой. Именно такая ситуация изображена на рисунке 4. Можно считать, что при R ≥ 1 пики разделяются до базовой линии (baseline separation). Базовой линией (baseline) называется линия фонового сигнала детектора. Базовая линия прописывается на хроматограмме, когда никакие компоненты не элюируются с колонки.
Теперь можно перейти к самому главному: к вопросу, какие факторы оказывают влияние на разрешение. Назову их сразу: это селективность α, эффективность N, а также удерживание k’ – и с последним мы уже знакомы.
1.1.3.2. Селективность как параметр, отражающий физико-химические взаимодействия в хроматографической системе
Величина, отражающая способность хроматографической системы к разделению веществ, называется селективностью (selectivity) системы по отношению к этим веществам. «Селективность» в переводе означает «избирательность».
Для двух пиков селективность можно вычислить непосредственно из хроматограммы как отношение фактора удерживания более удерживаемого пика к фактору удерживания менее удерживаемого: α = k’2/ k’1. При α = 1 (полное отсутствие избирательности хроматографической системы) разделения не происходит. Более того, его невозможно добиться применением более качественной хроматографической колонки, или любым другим способом, кроме как изменить саму хроматографическую систему: подвижную и/или неподвижную фазу. Разделение на данном адсорбенте при применении данного элюента принципиально возможно, только если α > 1.
Есть такая характеристика разделения как сложность разделения – пока я могу лишь посоветовать воспринять ее интуитивно. Так вот, сложность разделения очень быстро уменьшается с ростом селективности. Таким образом, селективность является ключевым фактором, влияющим на разрешение. Управление селективностью – это искусство выбора оптимального адсорбента и оптимального элюента для данного разделения.
Одним из преимуществ жидкостной хроматографии является возможность улучшения селективности без замены неподвижной фазы, путем грамотного изменения состава подвижной фазы и соотношения ее компонентов. Это свойство жидкостных хроматографических систем называется гибкостью (flexibility).
Термин «селективность» может также применяться в более общем значении – как свойство хроматографической системы успешно справляться с разделением сложного многокомпонентного объекта. Так, хроматограмма из n пиков характеризуется ½n(n-1) частными значениями селективности α. Но, понимая селективность как общее свойство хроматографической системы, этим термином можно назвать всю совокупность значений α.
В этом случае «селективность» подразумевает типичный для данной хроматографической системы порядок элюирования компонентов. При постоянной селективности хроматограмма всегда выглядит одинаково: пики могут быть шире или уже, анализ может занимать разное время – но последовательность элюирования, пропорции между факторами удерживания компонентов будут также всегда оставаться постоянными (см. рис. 5г, 5д, 5е).
- К. Сычев. Разделения одинаковой и различной селективностями. А, б, в – разделение трехкомпонентной смеси в системах с различной селективностью: б – селективность отлична от а), но порядок элюирования сохраняется, в – селективность отлична от а), причем изменяется и сам порядок элюирования. Г, д, е – разделения четырехкомпонентной смеси в системах с одинаковой селективностью: д – при отличной от г) эффективности, е – при отличном от г) удерживании. www.chromforum.ru
Рисунок 5. Разделения одинаковой и различной селективностями. А, б, в – разделение трехкомпонентной смеси в системах с различной селективностью: б – селективность отлична от а), но порядок элюирования сохраняется, в – селективность отлична от а), причем изменяется и сам порядок элюирования. Г, д, е – разделения четырехкомпонентной смеси в системах с одинаковой селективностью: д – при отличной от г) эффективности, е – при отличном от г) удерживании
Селективность данной хроматографической системы является суммарной характеристикой физико-химических взаимодействий в хроматографической системе: вещества с адсорбентом, вещества с элюентом и элюента с адсорбентом. Для изменения селективности надо либо заменить применяемый адсорбент, либо поменять состав элюента. Селективность также зависит от температуры, при которой проводится разделение.
1.1.3.3. Эффективность хроматографической колонки. Пиковая плотность. Асимметрия пика
Помимо других факторов, разрешение пиков зависит от того, насколько сильно размываются хроматографические зоны веществ при продвижении вдоль колонки. Чем сильнее их размывание, тем шире оказываются пики (при условии, что их времена удерживания не изменяются), и тем хуже они разрешаются.
Величина размывания хроматографической зоны определяется характеристикой, которая называется эффективностью. Чем выше эффективность, тем уже хроматографическая зона. Эффективность в значительной мере является свойством хроматографической колонки. На практике, конечно, размывание хроматографической зоны (соответственно, и ширина пика) зависит не только от характеристик колонки, но и от многих других факторов: физико-химических свойств целевых веществ, нагрузки на колонку, качества сборки жидкостной системы, выбора растворителя пробы, объема инжектируемой пробы и т.д.
Тем не менее, в некоторых идеальных условиях, когда влияние всех негативных факторов сведено к минимуму, можно считать, что эффективность разделения связана исключительно с хроматографической колонкой. В частности, эффективность определяется размером частиц адсорбента, качеством изготовления адсорбента и качеством заполнения колонки адсорбентом, а также параметрами, связанными с процессами диффузии в колонке: скоростью потока элюента и температурой.
На рисунках 6а и 6б показаны хроматограммы с одинаковым удерживанием компонентов и селективностью, но различной эффективностью (на рисунке 6б эффективность ниже). Конечно же, на колонках с высокой эффективностью разрешение выше.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение трехкомпонентной смеси с варьируемой эффективностью или асимметрией: б – эффективность ниже, чем в случае а), в – эффективность одинакова с а), но асимметрия пиков значительно выше. www.chromforum.ru
Рисунок 6. Разделение трехкомпонентной смеси с варьируемой эффективностью или асимметрией: б – эффективность ниже, чем в случае а), в – эффективность одинакова с а), но асимметрия пиков значительно выше
Эффективность можно вычислить по любому пику на хроматограмме:
N = 5.545 * (tR/w½)2, где
N - эффективность;
w½ - ширина пика на половине высоты, мин.;
tR - время удерживания, мин.
Это вычисление основано на предположении, что форма пика описывается кривой Гаусса, то есть кривой нормального распределения случайной величины.
Вообще говоря, эффективность – это безразмерная величина, но в хроматографии принято приписывать ей единицу измерения с довольно экзотическим названием: количеством теоретических тарелок, т.т. (plate number). Когда речь идет об аналитических применениях, любят характеризовать колонку именно эффективностью (количеством теоретических тарелок). Когда же речь заходит о теории хроматографии, то пользоваться предпочитают обратной ей величиной, которая называется высотой, эквивалентной теоретической тарелке, ВЭТТ (height equivalent to theoretical plate, HETP, H):
H = L/N, где
H - ВЭТТ, мм;
L - длина колонки, мм;
N - эффективность колонки, т.т.
Процедура определения формальной эффективности хроматографической колонки называют ее тестированием . Тестирование проводят при некоторой общепринятой скорости подвижной фазы (как правило, 1 мл/мин для колонок с диаметром 4.6 мм) и по некоторым общепринятым адсорбатам (к примеру, по толуолу или нафталину).
Эффективность хроматографической колонки в первом приближении пропорциональна ее длине; таким образом, при оценке качества упаковки колонки адсорбентом принято использовать значение удельной эффективности, то есть эффективности, отнесенной к единице длины. Для современных высокоэффективных колонок значения удельной эффективности лежат в интервале 80-230 тысяч теоретических тарелок на метр.
Для оценки разрешающей способности колонки иногда используют не эффективность, а величину, пропорциональную квадратному корню из эффективности. Она называется пиковой плотностью (peak capacity). Пиковая плотность равна числу пиков, которые могут быть расположены на хроматограмме до произвольно выбранного k’ друг за другом с разрешением, равном единице. Пиковая плотность связана с эффективностью колонки зависимостью:
n = 1 + 0.6*√N*lg(1+k’), где
n - пиковая плотность;
N - эффективность;
k’ - фактор удерживания последнего компонента.
Выше мы описывали пик симметричной формой кривой Гаусса. На практике, однако, пики бывают разными, в том числе асимметричными. Коэффициент асимметрии Ка вычисляется как отношение «правой» полуширины пика к «левой» на одной десятой его высоты (см. рис. 4). При одинаковой эффективности асимметричные пики разрешаются хуже (см. рис. 6а и 6в).
1.1.3.4. Связь разрешения с селективностью, эффективностью и фактором удерживания
Подведем итоги. Существуют три фактора, влияющих на разрешение двух пиков: селективность хроматографической системы α, эффективность колонки N и величина удерживания k’ данных двух веществ.
Самым важным фактором является селективность системы α. Изменить ее можно, изменив саму хроматографическую систему. Для этого необходимо либо заменить неподвижную фазу (выбрать колонку с другой маркой адсорбента), либо серьезно изменить состав элюента – то есть не просто изменить соотношение смешиваемых растворителей, а, например, заменить один растворитель на другой.
Для оптимизации разделения, однако, селективность надо не просто изменять, а улучшать, то есть изменять в нужную сторону. Чтобы делать это целенаправленно, необходимо в общих чертах понимать химизм процессов, происходящих в хроматографической системе. Тем не менее, дело того стоит: ведь даже небольшой рост селективности приводит к серьезному улучшению разрешения при фиксированном времени анализа, либо к уменьшению времени анализа при фиксированном разрешении.
Вторым по значимости фактором является эффективность N, которая в оптимальных условиях элюирования определяется только типом и качеством изготовления хроматографической колонки. Увеличить эффективность можно достаточно просто – например, взять более эффективную колонку, то есть либо имеющую большую длину, либо заполненную адсорбентом более мелкого зернения. Недостаток этого подхода – увеличение времени анализа (при фиксированном давлении в системе).
Наименее значимый эффект на разрешение оказывает величина удерживания k’. Только для наименее удерживаемых компонентов с k’ < 2 увеличение удерживания приводит к видимому улучшению разрешения. При k’ порядка 3-5 уже можно считать, что удерживание практически никак не сказывается на разрешении. Из этого надо сделать всего один вывод: удерживание целевых соединений по возможности должно быть не менее k’ = 2.
Эти эмпирические правила можно выразить количественно. Формулу, связывающую разрешение R со значениями α, N и k’, иногда называют основной формулой хроматографии:
R = ¼ * (α-1)/α * √N * k’2/(k’2 + 1), где
R - разрешение;
α - селективность;
N - эффективность;
k’2 - фактор удерживания второго пика.
Для каждого конкретного случая можно назвать свой наиболее оптимальный путь улучшения разделения. В том случае, когда плохое разрешение является следствие слишком слабого удерживания (см. рис. 7а), то удерживание следует несколько увеличить, к примеру, до оптимального значения 2 < k’ < 4 (см. рис. 7б). Дальнейшее увеличение удерживания приведет только к росту времени анализа при почти неизменном разрешении (см. рис. 7в).
На хроматограмме, приведенной на рисунке 8а, недостаточное разрешение связано, очевидно, с низкой эффективностью, поскольку и с удерживанием, и с селективностью проблем нет. В этом случае необходимо взять более эффективную колонку (см. рис. 8б).
Наконец, в случае недостаточного разрешения при вполне приемлемых эффективности и удерживания (см. рис. 9а), улучшить ситуацию можно, лишь изменив селективность (см. рис. 9б).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение при увеличении удерживания k’. www.chromforum.ru
Рисунок 7. Разделение при увеличении удерживания k’
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение при увеличении эффективности N. www.chromforum.ru
Рисунок 8. Разделение при увеличении эффективности N
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение при улучшении селективности α. www.chromforum.ru
Рисунок 9. Разделение при улучшении селективности α