Механизмы удерживания на остаточных силанольных группах

[Serga]

Вроде все ясно с этим вопросом. Считается, что силанольные группы ионизированы при рН>3,0, в зависимости от сорта силикагеля и степень ионизации может составлять уже при рН=3 около 10-50% (опять же, в зависимости от сортности). Ионизированный -О- взаимодействует электростатически с протонированным азотом органического основания, что и является причиной хвостообразования при ВЭЖХ азотистых соединений в элюентах при нейтральных рН и отсутствии буферов и блокирующих силанолы добавок (триэтиламин и т.д.). Я прав?

[Serga]

Граждане! Тыкните носом на ссылку, где на русском языке описано более-менее прилично взаимодействие оснОвной органики с силанолами. Чтоб я мог, в свою очередь, тыкнуть носом других. Ибо у меня уже аргументов не осталось, кроме как прибегнуть к посторонней помощи.

[Константин Сычев]

Мм.. Сергей, а это и не факт вовсе - что все уширение всяких пиков объясняется только какими-то там силанолами. Для начала, силанолы есть на силикагеле. А на полимере? их нет, а уширение - есть. И точно так же основания уширяются и хвостят сильнее, чем другие групы соединений.

Доподлинно можно утверждать, что примеси металлов (опять же, никто никогда не уточняет КАКИХ металлов) явно способствуют появлению хвостов у оснований, а особенно - у хелатирующих соединений типа 4,4'-бипи, оксихинолина, о-фталевой к-ты, тетрациклина и т.д., которые входят в некоторые тестовые смеси. А вот с силанолами ничего и непонятно как раз. Оценить их вклад в удерживание - без проблем. А в уширение - никто еще не придумал такого эксперимента. Потому как, наверное, представить себе "остаточные силанолы" без контекста (металлы, привитая фаза и т.д.) весьма сложно даже чисто умозрительно.

Дальше - больше. А чего тут думать - может быть, скажете Вы, - возьмем силикагель, один закатаем С18 посильнее, другой послабже. В первом доля силанолов будет меньше. Значит - меньше и уширение. Так вот - ничего подобного. Наоборот - больше, причем видно это невооруженным взглядом.

В свое время (очень давно, я еще в школу, понимаете, ходил) занимались мы интересным эффектом - уширением пика бензойной кислоты в определенных условиях. Бензойная кислота - потому что это просто - один карбоксил, один "реакционный центр". Снимали на С1, с4, с18 силикагелях и полистироле. Хитрость условий сводилась к тому, что рН должен был быть где-то в диапазоне 5-6, на единицу одну-две больше рКа. Так вот - уширение пика (а там оно уширялось на целые k'-хи) планомерно возрастало от с1 к с4 к с18 и к полистиролу. Т.е. чем гидрофорбнее брали обращенку - тем больше уширение. И силанолы ну явно тут ни при чем.

Вот пару смешных картинок - 1д (С18, элюент с неорг. солью, подкисление фосфатом), 2 (полистирол, элюент с неорг. солью, подкисление фосфатом), 3 (с18, подкисление соляной к-той, без неорг. соли). Хроматограммы типа 2 мы называли гордо "сапогом", а типа 3 - "ж..й". В зависимости от рН, доли ацетонитрила, открытой форточки и прочего все эти коленца плавно перетекали друг в друга.

По результатам была у нас в воронежском журнале немного наивная, но по сути, как я до сих пор уверен, верная статья. Общий смысл - ассоциация адсорбатов в приповерхностном слое.

До оснований руки не дошли. Но ассоциация оснований (даже в растворе) - вещь общепризнанная.

[Maestro]

То что силанольные группы не единственная причина уширения понятно. Тем более после такого сообщения . Но добавка триэтиламина направлена непосредственно на блокирование силанольных групп?
И если, скажем, работать на хорошей колонке, анализируя основания, не наблюдать уширения пика. А потом (после длительной работы, отлетел эндкеппинг) пик начал уширяться. То в таком случае металлы не причем, их же больше в силикагеле стать не могло, а вот открытых силанольных больше стать могло. Вопрос, только была ли у кого такая история

[Константин Сычев]

Добавка триэтиламина направлена на все возможные причины уширения - поэтому она и универсальна. Она и поверхность закроет, и самоассоциаты разрушит.

А уширение, которое появляется на старой колонке - это, как правило, банальное проседание адсорбента (мертвый объем на входе колонки). Химия тут ни при чем.

[Serga]

Просто я не могу доказать челу, что азотистое основание цепляется только за ионизированный силанол чисто электростатическим взаимодействием (если оно протонировано и имет заряд). Мне пытаются доказать, что основной вклад вносит, видите ли, водородная связь между непротонированным азотом основания и водородом неионизированной группы -ОН силанола.

Исходя из общего опыта (когда подкислением элюента или добавлением триэтиламина) блокируют ионизацию или заряд -ОН силанола, никаких водородных связей (и тем более, взаимодействия свободной пары электронов азота с водородом -ОН группы) быть не может (по крайней мере, в качестве основной причины). Бесполезно. Тыкаю в англоязычные статейки, где разжевывают причины хвостообразования оснОвных соединений на силикагеле и пути его устранения- не помогает.
Я уже упарился.
В ответ слышу- (дословно) "поскольку на силикагеле есть два центра удерживания- -ОН и С18, то можно разделить (!) существующие формы азотистого основания- протонированную (она, типа, сидит на С18 группах) и непротонированную- она цепляется (!) за неионизированную -ОН силанола. А поскольку кремниевая кислота слабая, то все -ОН неионизированы до рН=8 или даже 10)" .
ППЦ...
Я считаю, что никакой хроматографией в принципе невозможно разделить протонированное и непротонированное основание за один RUN. Не помогает. Проще рассчитать их соотношение при известном рН, зная его рКа по Хендерсону-Хассельбаху. Зачем что-то делить, если и так элементарно рассчитывается.

Что касается полимерных сорбентов, то уширение пиков на них происходит за счет диффузии низкомолекулярной органики в полимерную решетку. Это мое мнение. В этом смысле силикагель вне конкуренции. Эритромицин (за счет относительно большого размера молекулы) может и можно делать на сшитом стирол-дивинилбензоле, а остальное все- будет бесстыдно хвостить. Полимеры хорошо делить.

[Константин Сычев]

Ну, человек без царя в голове, это видно по словам.. я любил так рассуждать лет в 10

.. но в самом подходе есть рациональное зерно. Я бы не стал категорически отрицать саму возможность чего-то подобного.. Поясню.. Чтобы что-то разделить, каждое "что-то" должно быть устойчиво не только в фазе адсорбента, но и в фазе раствора. Устойчиво - это ключ.. что значит устойчиво? Что значит существовать по вэжх-шным рамкам довольно долго?.. наверное (выдумываю находу) dp/v - это где-то порядка миллисекунды. А партия нас учит тому, что скорость протонного обмена при около-нейтральных рН как раз опускается до этого значения.

Я ничего этим не утверждаю - просто привожу такой вариант рассуждений.. из-за него я как раз не берусь ничего утверждать

[Serga]

Да я понимаю. Всяко бывает. Но опять же, из опыта ионообменной хроматографии, никогда не случалось такого, чтоб что-то проскочило мимо сорбента из-за того, что не имеет ионной формы (при наличии в равновесии его же ионизированного собрата). А скорости посадки там приличные- линейная доходит до 300+ см/час. А если там протонный обмен ничего не лимитирует, то в ВЭЖХ и подавно не должен.

Откуда вообще взялся весь спор. После окончания градиента не вернули элюент на "начало", оно так и шуровало 100%. Он ввел пробу, она вышла частично. Потом, после резкой смены на начало градиента вышло и остальное. И тут началось! (Построение теории разделения равновесных форм).

А мое ИМХО такое, что просто село основание на ионизированых силанолах (из 100% MeCN), а потом оно "слетело" на кислом водном элюенте, замешанном пополам с ацетонитрилом. Чему места не хватило сесть, то вылезло вперед еще на MeCN. Дело тут в том, что концентрации были мизерные, а детекция шла МС. Но таким образом, ИМХО, можно сосчитать только число активных центров на колонке, и не более того. Да и то- очень приблизительно. Потому что на МС видно даже (в следах) то, с чем работали неделю назад. Десорбция протекает не слишком количественно и небыстро. Из-за этих свободных силанолов очень напряжно работать для МС без буфера или ТЭА. Воспроизводимость в режимах единиц ppb сильно зависит от установления равновесия.

Я не думаю, что в случае клофелина или эфедрина, даже с обратным градиентом (как оно получилось) можно говорить о разделениях форм одного и того же соединения.

[Сергей]

В качестве замечания: насчет влияния остаточных силанольных групп на уширение пиков, насколько я знаю, не существует ни одного экспериментального подтверждения - в основном глубокомысленные компиляции друг у друга на тему: ну ведь все так считают. Вдобавок сообщаю, что грамотный эксперимент здесь поставить очень сложно (догадайтесь, почему?), поэтому с этой штукой и никто не связывается - боятся (вполне справедливо) опозориться. Поэтому....бла-бла-бла...остаточные силанольные группы и ни одного подтверждения. Ребята, сделавшие работу по уширению на основе гипотезы ассоциации тоже очень рисковали и , насколько я знаю, эти вещи не печатали долго - боялись. Вообще эта дискуссия похожа на древнюю задачку про мертвый объем колонки. Лет 6 -7 С.Н.Сычев, казалось бы, поставил точку в этом вопросе, ан нет - до сих пор вылезают буераки с задумчивыми лицами. Так что не надо нам навязывать импортные понятия - сами с усами.

[Serga]

Так что не надо нам навязывать импортные понятия - сами с усами.

Довольно интересное заявление. Только о "наших понятиях" я так и не понял- какие у нас все же понятия на этот счет?
Вообще, очень интересно получается. ВЭЖХ у нас распространилась (более менее широко) всего-то лет 10 назад. А до того "понятия" о ней имел довольно узкий круг лиц. А теперь поди ж ты- у нас свои понятия появились. Правда, очень туманные. Вопреки всеобщей практике.

[Константин Сычев]

После окончания градиента не вернули элюент на "начало", оно так и шуровало 100%. Он ввел пробу, она вышла частично. Потом, после резкой смены на начало градиента вышло и остальное.

Сергей, Вы подали забавную идею - наладить разделение оснований в протонированной форме в HILIC режиме. С точки здения аналитики, правда, система выглядит коряво и наверняка неустойчиво (не-robust). Но зато интеерсно - обязательно попробую этот вариант

[Сергей]

Сереж, ну немножко повыпендриваться, никому не запрещено - ну извините. Насчет свободных силанольных групп - действительно ведь экспериментального подтверждения нет - а только одна болтовня. Ну а Вам замечание - за выпендреж я получил, а внятных контаргументов не увидел. Вернее увидел, типа .... развелось вас тут...и все лезут...лучше бы книжек побольше читали и у старших спрашивали.... За выпендреж я извинился, а как Вы со своими аргументами будете поступать?

[Сергей]

И еще по поводу разделения разных форм ассоциатов. Недавно общался с С.Н.Сычевым по этому поводу. Он немножко посмеялся над нашим энтузиазмом и объяснил, что в растворе (а детектор просматривает именно раствор) просматриваются только усредненные формы, характерные для аналита в элюате. Ассоциация же формируется и существует только на поверхности адсорбента и проявляется в различном массопереносе форм в адсорбционном слое. Получается как в телевизоре - пощупать мы ничего не можем, а реплики увидеть можем. Эксперимент так и был построен - на ловлю откликов от различных форм ассоциации. Вполне понятно и доказательно. Насколько я знаю, С.Н.Сычев использует знания об этом эффекте около 20 лет в практической хроматографии.

[Serga]

Я не очень понимаю, что такое "разные формы ассоциатов". Вероятно, они существуют, но насколько велик вклад каждой из них? Я имел в виду протонированную и свободную форму основания:
R-NH3+ ---> R-NH2 + H+
Причем, я даже не учитываю никаких других взаимодействий, кроме как "протонированное основание- ионизированный силанол". Иначе и вовсе крыша съедет. Методы устранения хвостов косвенно свидетельствуют о том, что именно эти взаимодействия являются основными. (Иначе становится трудно объяснять подкисление, добавление соли, добавление ТЭА).
По крайней мере, "альтернативные" теории как -то не попадаются. А все об одном речь идет. Да и вся практика настроена так, что борются с ионизированными силанолами.
Насчет доказательства- есть статейка на этот счет:

R. Ruiz et al. Hydrophobic and cation exchange mechanisms in the retention of basic compounds in a polymeric column/Journal of Chromatogr. A. 1028 (2004) 139-148.

Там работали на полимерной колонне PLRP-S 100A и силикагелевой MS XTerra C18.

[Сергей]

За ссылку спасибо, посмотрю. Количество ассоциатов на поверхности значительно больше, чем в растворе, при ближайшем рассмотрении крыша не едет, а описывает такую систему в виде наложенных концентрационных пиков различных ассоциатов. Добавка уксусной кислоты и диэтил или три - этиламина призваны задушить такое разнообразие именно на поверхности, т.е. является своеобразным динамическим модифицированием поверхности (преимущественно). При таком модифицировании происходит достаточно сильное изменение свойств поверхности. В разбавленных же растворах аналита преимущественно существуют простейшие равновесия, вроде такого, что Вы привели в пример - там больше и существовать более сложные структуры не могут. Конечно, предложенные Вами формы выделить нельзя, а увидеть их отклики - можно. Динамическая модификация поверхности одновременно приводит к тому, что и приведенные Вами равновесие сдвигается сильно в одну сторону и в растворе тогда наступает тишь и благодать (с точки зрения хроматографиста). С точки зрения физхимика, коим я являюсь, мне как раз интересней формы существования ассоциатов на поверхности адсорбента - не здесь ли зарыт ключик к гомеопатии или избирательной токсичности? Вот об этом и у нас с Сычевым-ст. был разговор. И еще про то, что все говорят - а своя голова на что? Помните что сказал по этому поводу Мюллер Штрилицу?

[Константин Сычев]

немножко посмеялся над нашим энтузиазмом и объяснил, что в растворе (а детектор просматривает именно раствор) просматриваются только усредненные формы

какая разница, что видит детектор.. Чтобы на пике появился изгиб или максимум, необходимо, чтобы определенная форма адсорбата сумела просуществовать в растворе достаточное время, чтобы, грубо говоря, перескочить от одного контакта с НФ к другому в неизменном виде. Потом - согласен - этот эффект суммируется, и получается пик с двумя или большим числом максимумов, в большей или меньшей степени разделенных "перемычкой".

Другое дело, что я не знаю - каков порядок этого времени. Может быть, это знают люди, которые занимаются определением энергии активации взаимопревращения ротационных изомеров при помощи хиральной вэжх - я не вникал в смысл их расчетов. Может, Даванкова можно спросить. Тут у меня два мысли - что это либо что-то вроде миллисекунд (время пробега между частицами) или вообще микросекунд (время диффузии в небольшие поры, а также существования адсорбционного комплекса).

Вобщем, это все увлекательно, но знаний у меня не хватает вот так вот все разложить по полкам.

А основания прекрасно ассоциируются по схеме RNH2--H--2HNR

[Сергей]

Только не в растворе, а в объеме поверхностного слоя. На выходе разными пиками выводится одна и та же простейшая равновесная смесь, только по времени и форме эти пики получаются разными из-за разного массообмена разных ассоциатов с поверхностным слоем. Чем больше емкость поверхностного слоя - тем больше разница во временах удерживания. Как только ассоциат выскочил в ПФ - все многообразие их исчезает. По крайней мере спектральные отношения выходящих из кюветы пиков одинаковы на всем их протяжении. Если бы выходили разные ассоциаты, это можно было бы заметить по спектральным отношениям (такой эксперимент был поставлен). Т.е. многообразие ассоциатов существует только на поверхности и в объеме сорбента, а никак не в растворе - это Вам я как физхимик говорю.

[Константин Сычев]

многообразие ассоциатов существует только на поверхности и в объеме сорбента, а никак не в растворе

я тоже склоняюсь к этой мысли - тогда достаточно времени жизни ассоциата порядка микросекунд.. то есть остается сравнимой со скоростью протонного обмена в объеме воды даже при рН 4-5, не говоря о водно-органических смесях.. в принципе даже это все можно спектроскопическими методами доказать.. только кому это надо) кстати, можно поставить также эксперимент, который покажет - надо ли разделять по смыслу "поверхность" и "приповерхностный слой".. например, сравнить рамановские спектры вещества с k' около 1 при влажном и сухом адсорбенте.. исли спектры отличаются - надо эти вещи разделять..

[Serga]

Че то нас потянуло в дебри теории.
Что касается меня, мне интересней знать, как все-таки стабилизировать процессы хроматографии микроколичеств основания, если не прибегать к модификации ТЭА, или тут в принципе нельзя обойтись без ТЭА. Потому как наблюдается такая вещь- пока в колонке не побывает лошадиная доза в 20 мкл 1-10 ррm вещества, не воспроизводятся десятки и сотни ppb, не говоря уже о ppt. Потом наступает какое-то равновесие (хотя стабильности площади пика все равно нет). Ясно, что происходят процессы сорбции-десорбции, они идут постоянно и всю картину портят. Наутро, к примеру, надо опять начинать с "насыщения" колонки лошадиной дозой аналита, после чего, когда "сошлейфит" лишняя доза, что-то начинает появляться. Это достало. ТЭА не есть гуд, но и существующие "теории" ничего другого не дают.
Теория ассоциатов тоже не дает ответа- как всю эту канитель преодолеть, а качество колонок пока еще оставляет желать и желать. Понятно, что для минимизации траблов надо минимизировать колонку, выбрать сорбент покачественней, но - не напасешься.

[Константин Сычев]

Сергей, на что я Вам всегда советовал купить хорошую колонку.. Что это за страшные основания такие? Вы в Москве? можете его передать в Элсико, например? только ppt меня не устраивают, мне бы чтоб видно было на уф. Например, такая комбинация - условно чистое вещество, один образец с ним + хроматограммы на Вашей колонке с хвостящим пиком. Чтоб я мог сделать рекламное разделение.

[Serga]

Да в том то и дело, что на концентрациях УФ это все (проблемы) отсутствует, как класс. Начинается все на уровнях ppb. Тот же клофелин (clonidin), другая аналогичная ерунда видится на уровнях 35 ppt (правда, не на матрицах, а в стандартах) и ниже. Но начинаются фокусы с процессами сорбции-десорбции уже на концентрациях десятков ppb, влияющие на воспроизводимость площадей. Колонка Термовская HyperSil Gold С18. Она немного крупновата для МС- 4*150 мм, 5 мкм. Надо бы 2 или 3 мм. (Есть, но пусть разберутся с этой вначале).
То есть, заметен постоянно спадающий фон (после каждого ввода) этого вещества. На УФ его едва ли разглядишь, кажется, что уже "давно ноль", а им не пахнет. Лезет то, что нацеплялось по "альтернативным" механизмам взаимодействий. Разумеется, если долго не "колоть" и мыть, фон когда-то спадает до нерегистрируемого уровня. Только потом, если уколоть, не увидишь и 100 ppb, они банально садятся на сорбенте. Ну да фиг с ним. Тут надо модификатор применять. Вопрос только- что будет с чувствительностью и как себя поведет в этом случае ловушка.

Есть еще одна интересная тема- бацитрацин. Антибиотик полипептидной природы. Циклический полипептид с небелковым хвостом. Обычно мы привыкли, что если сделать "сильный" элюент, вещество практически не держится и вылезает рано, как правило, узким пиком. Эта штука ведет себя своебразно. На сильном элюенте (50-70% MeCN в формиатном буфере при рН=3) в виде пика оно вообще не выходит, но видно, как идет шум от него. То есть, как-то банально размазывается по колонке. На слабых элюентах форма пика безобразная с уродливым передним фронтом и только в градиенте получается нечто удобоваримое, но передний фронт заметен (особенно на небольших концентрациях). Насчет его гидрофильности/гидрофобности сказать трудно что-то определенное. полипептид он и в африке ПП, теоретически плохо просчитывается. Ну и выходил бы себе ранним пиком- так нет же- вообще исчезает. Ему-то чего не хватает?

[Константин Сычев]

Мм.. скорее, виновата колонка. Во обоих случаях. Она вообще новая или старая?
И элюенты - они везде кислые, в т.ч. и на клофелине? Вообще, это не дело - надо переходить хотя бы на нейтральный рН..

[Сергей]

Сообщение удалил, а то стыдно

[Константин Сычев]

Трис ты использовал, потому как адсорбенты были полное ... не того качества на чистом от металлов силикагеле нет никакого уширения пептидов.. разве что специально выискивать эти суперузкие диапазоны рН, в которых что-то там может происходить с самоассоциацией.. кстати, у меня сейчас есть свеженькая очень пафосная С18 как раз вроде как суперинертная.. постулируется идеально симметричный пик тетрациклина.. проверим!

Могу даже сказать, почему она будет интересна - это идеальная колонка для экспериментов по уширениям. Никто не скажет, что это из-за "силанолов" или "металлов"..

[Maestro]

Ну никак не могу не спросить, что это за колонка ))) Если нельзя написать ее данные в общем форуме, напишите хоть в ЛС. И вообще, откуда такая уверенность в качестве сорбента (без металлов и открытых силанолов) у производителя? Золь-силикагель уже не самый очищенный от металлов что ли, какие-то более новые технологии появились по получению силикагеля?
p/s/ Давно не слышал про трис, признаться честно.

[Serga]

Прежде, чем чего-то анализировать - ну хоть книжки посмотрели бы.

За кого вы нас держите?
Да не в том дело- смотрели-не смотрели. Делить пептиды- не наша забота. ПП и пептидные дайджесты делаются практически в единых условиях- трифторуксусная кислота в элюенте, нормальный градиент и обращеная фаза. Поскольку ТFA сильно давит ионизацию в электроспрее, снижают ее концентрацию и добавляют формиат. Тогда ПП и делятся, и "видятся". Это- если надо делить кучу обломков полипептидов. В общем, америку тут изобретать не надо. И даже лишний раз лезть "в книжки"- тоже. Есть нюансы в зависимости от- чем детектить- УФ или МС. УФ позволяет не идти на компромисс и по полной оптимизировать хроматографию. С МС сложнее.
Если надо бацитрацин- можно обойтись и без этих премудростей, но среда все равно кислая (0,5% НСООН). В таких условиях образуется преимущественно двузаряженный бацитрацин с m/z=712. С бацитрацином никаких проблем не испытывается. Я спрашивал у физхимиков (тутошних )- отчего так себя оно ведет, а не как его делить и считать. В надежде, что у вас есть наготове "новые теории" ассоциатов или фиг еще знает чего. Но увы. Где теории? Те несколько пептидов, которые составляют бацитрацин, оптимизированы в хроматографии и МС-детекции, но меня интересует вопрос особенностей его поведения, вот в чем дело. (Кстати, о птичках. Эта штука, несмотря на свои "особенности", воспроизводится с завидным постоянством, чего не скажешь о том же тетрациклине ).
Тетрациклин тоже делится и определяется нормальными пиками, хоть в мясе, хоть в колбасе. Можно крутить-вертеть с морем способов пробоподготовки, подгоняя их для своего удобства. Там пределы 10-50 мкг/кг (ppb). Но "особо инертная колонка" только улучшит дело. Тетрациклин для МС нельзя делать в нейтральной среде- не увидишь ничего хорошего. Тетрациклин в нейтральной среде тоже имеет плюс и минус в одной молекуле одновременно, как и аминокислоты.
Конечно, мы бы поискали "особо хорошую колонку", но: я не уверен, что спустя некоторое время "особо инертная колонка" от работы с TFA (или просто так, само по себе) не станет "самой обычной колонкой", со всеми вытекающими... И все вопросы всплывут опять.

[Serga]

Мм.. скорее, виновата колонка. Во обоих случаях. Она вообще новая или старая?
И элюенты - они везде кислые, в т.ч. и на клофелине? Вообще, это не дело - надо переходить хотя бы на нейтральный рН..

Колонка, скажем, не первой свежести. Вопрос кислотности элюентов диктуется детектором. Для МС надо, чтоб в ряде случаев оно было кислым. Т.е., 0,1-0,5% НСООН в буфере- практически обычное дело. Там, где позволяет детекция, работается и на нейтральном буферном эдюенте.

[Serga]

Обычный рН такой изоэлектрической точки лежит в диапазоне от 7,5 до 6,5. Если включить только подкисленный (и солидно) элюент в большинстве случаев вообще выходить ничего не будет - задавите кислотный остаток и в кислой среде будете анализировать сильное основание (я думаю ТЭА тоже не спасет). В детстве в большинстве случаев использовал трис-буфер с метанолом или ацетонитрилом. Посмотрите - в любой книжке по аминоккослотам и пептидам приведена зависимость времени удерживания от рН и содержания ацетонитрила вроде перевернутого параболоида). У Хеншена такие системы описаны, у Рудакова приведены то ж. Ребята! Прежде, чем чего-то анализировать - ну хоть книжки посмотрели бы.

ТРИС-буфер используют в гель электрофорезе, скорее. В ВЭЖХ немодифицированных аминокислот и пептидов??? Че то про такое не слышал. рI аминокислот разнятся сильно, как вы собираетесь для всего подобрать "изоэлектрический" рН? Это нереально, да и бесполезно. При нейтральных средах оно не делится совсем на ОФ-ВЭЖХ. Все делят в сильнокислоых средах, либо с TFA, либо с ионными парами (с гептафтормасляной или даже более длинной перфторкислотой- кто что найдет). Для МС это неприменимо, в большинстве случаев. Сильнокислая среда нужна как раз для подавления ионизации альфа- и боковых карбоксильных групп. Тогда начинается удерживание.

[Сергей]

Я же предупреждал, что могу напутать! В голову что-то вступило, и я перепутал пептиды и полипептиды с нуклеотидами и нуклеозидами. Сам над собой смеялся, потому что, в силу обстоятельств сейчас занимаюсь нуклеотидами и нуклеозидами - и не думая впорол! Прошу прощения, конечно нужна хорошая колонка и подкисленный фосфоркой элюент лучше с добавлением ДЭА или ТЭА + какой-нибудь 0.02М однозамещенный калий - так эта система проста и безотказна . Когда перехожу на масспектрометр, стараюсь оставить одну фосфорку, а картинку подогнать под элюент Вода - ацетонитрил - 0.02М однозамещенный калий - ДЭА - фосфорка. С этим элюентом получается практически все, а только с фосфоркой - далеко не всегда. Еще раз извиняюсь, что набуровил: прочитал Ваше сообщение и ахнул - вот до чего доводит работа! Свой идиотский файл удалил, а то стыдно.

[Константин Сычев]

Кстати, я заметил важную неточность в названии темы - мы обсуждаем механизмы уширения пиков

А удерживание на доступной полярной поверхности силикагеля С18 фаз ничем не отличается, естественно, от удерживания на силикагеле. Про удерживание и разделение протонированных оснований на силикагеле - это интересная идея. Как уже говорил - при возможности попробую. Можно, кстати, начать с четвертичных катионов - например, удобных алкалоидов чистотела (я с лета чистотела немного припас). А потом подкислить и посмотреть все остальные. Кодеин, опять же, в таблетках еще водится.

Мне, вообще, давно хотелось исследовать удерживание на силикагеле воды

Все интересные разделения, которые я имею право выкладывать, после обработки буду помещать в раздел новостей.

[Serga]

Именно. Поскольку алифатические амины имеют рКа начиная от 9 и далее, львиная доля алкалоидов несет "+" в очень широком диапазоне рН элюентов, вплоть до непереносимых никакими силикагелевыми колонками. Поэтому и приходится бороться с малым временем удерживания, сопровождаемым еще и побочными эффектами.

[Serga]

я заметил важную неточность в названии темы - мы обсуждаем механизмы уширения пиков

И? Причиной являются силанольные группы? Они. Потому как в явном виде никаких других причин заявлено не было. Были какие-то туманные ссылки на какие-то теории, но ничего конкретного.

[Константин Сычев]

Ну, если для Вас уширение пика и удерживание вещества - это одно и то же, то я сдаюсь..

[Serga]

Да ладно?!
Уширение пика возможно по разным причинам, в том числе и по причинам удерживания. Или не так?

[Константин Сычев]

Нет, конечно. Вколите на С18 толуол.. никакого уширения пика не будет - хоть он на 10 минутах выходит, хоть на 30, хоть на 100. Прямую зависимость скорректированной эффективности от удерживания я наблюдал один раз в жизни.. на хитрой фазе.. в хитрых условиях.. И посчитал, что человечество еще к этому не готово, и результаты не опубликовал.. а может, мне просто лень было.. обвинили ли бы в пустом фантазерстве, начали бы критиковать.. кому это все надо..

Удерживание - это результат такой обобщенной величины взаимодействия вещества с неподвижной фазой. А уширение (формально) происходит от того, скорость установления адсорбционного равновесия уже такое медленное, что сопоставимо со скоростью хроматографирования.

Вот предположим, что удерживание происходит по двум механизмам (пока не задумываясь о строгом определении механизма, просто воспринимая интуитивно). Вклад второго механизма очень-очень мал. Удерживание по обоим механизмам вполене приличное и сопоставимое по величине. Разница такая - по первому механизму процесс адсорбции-десорбции происходит быстро, а по второму - медленно. Тогда удерживание определяется первым механизмом, а второй лишь добавляет длиннющий "хвост".

Вот второй случай. Удерживание также происходит по двум механизмам, вклад второго механизма сопоставим с первым, процесс адсорбции-десорбции происходит быстро по обоим механизмам. Тогда никакого уширения нет, а удерживание определяется суммой двух механизмов.

Теперь понимаете, почему я не стал публиковать результаты, в которых уширение напрямую зависело от удерживания? Для хроматографистов это непривычно, это исключительный случай. А вот для химика-органика корреляция скорости реакции и полноты ее протекания - это нормально. Он бы плохо воспринял именно ситуацию с хроматографией.

А разница-то "всего-то" в различии механизмов межмолекулярного взаимодействия. Никому они не нужны, никто их не изучает, а потом все удивляются.

[Serga]

Удивляются.
Почему, когда вводишь меламин (2,4,6-триамино-1,3,5-триазен) из раствора в элюенте (40/60 МеCN/0.1% HCOOH) пик нормальный (ну, как эйфелева башня), а когда вводится оно же из ацетонитрила (80-95%)- безобразно уширяется? (как ледяная горка, с которой скатываются. Скажу по-другому- прямоугольный треугольник с катетами 1:2, если его положить на гипотенузу).
Вот чего ему не хватает?
(Сделали денатурацию ацетонитрилом и центрифугат анализируют- отсюда берутся такие образцы).

[Константин Сычев]

Ну, это не уширение по химическим причинам, которые мы обсуждаем. Это тривиальный случай.. вот скопируйте кусочек из моей книжки (в приложении). И я его уберу - мне выкладывать части книги для скачивания нельзя..

[Константин Сычев]

Вот файл..

[Serga]

Спасибо. В общем, понятно. Правда, меламин лучш в воде растворяется, чем в ацетонитриле. Но тем не менее...