Развитие теоретических представлений в хроматографии происходило постепенно. Исторически сложилось так, что теория газовой хроматографии начала развиваться раньше, чем теория жидкостной хроматографии.
Первой была разработана теория тарелок. В ней, как уже указывалось, было дано понятие о высоте, эквивалентной теоретической колонке, ВЭТТ. Теория тарелок дает очень важную формулу, которая описывает зависимость разрешения двух пиков от трех факторов: селективности, фактора удерживания и эффективности (или обратной ей величины ВЭТТ). Именно поэтому теория тарелок была рассмотрена в первую очередь (см. гл. 1): без нее нельзя было рассказать, каким образом можно увеличить разделение двух пиков.
В плане же оптимизации разделения тарелочная теория не дает ровным счетом ничего. В ней вводится само понятие ВЭТТ, но не объясняется, какое влияние на ВЭТТ оказывают различные факторы: размер частиц адсорбента, скорость потока, диффузионные процессы внутри колонки и т.д. Все эти вопросы рассматриваются в теории скоростей, которая исторически появилась после теории тарелок.
Основной зависимостью в теории скоростей является уравнение Ван-Деемтера, которое устанавливает связь между ВЭТТ и скоростью подвижной фазы:
H = A + B/u + C*u, где
Н – высота, эквивалентаная теоретической тарелке, ВЭТТ,
u – линейная скорость элюента,
A, B, C – коэффициенты.
Это уравнение хорошо применимо и в жидкостной хроматографии для современных высокоэффективных колонок, заполненных адсорбентами на основе силикагеля с размером частиц 3-5 мкм.
Надо отметить, что u – это не объемная скорость потока, а линейная, выраженная, к примеру, в сантиметрах в секунду. Линейная скорость может быть пересчитана из объемной скорости, если известна общая пористость упаковки εm, то есть доля объема колонки, доступной для элюента. Обычно εm варьируется от 0.7 до 0.8, ее точное значение надо определять для данной колонки экспериментально.
Если линейную скорость требуется вычислить однократно, то удобнее просто разделить длину колонки на экспериментально определенное значение нулевого времени:
u = L/t0,
где t0 выражается в секундах, L в сантиметрах и u имеет размерность см/сек.
Если проводится работа по определению зависимости Ван-Деемтера, то для каждой колонки сначала надо рассчитать εm, зная экспериментальное значение t0:
εm = (4*v*t0)/(π*60*L*dc2), где
v – объемная скорость потока, выраженная в мл/мин,
t0 – экспериментальное нулевое время, выраженное в секундах,
L – длина колонки, см,
dc – диаметр колонки, см.
Тогда линейную скорость для данной колонки можно будет напрямую вычислять из объемной скорости потока:
u = 4*v/(π*60*εm*dc2),
где u выражается в см/сек и v выражается в мл/мин. К примеру, пусть εm = 0.75, тогда при объемной скорости 1 мл/мин линейная скорость будет составлять 0.267 см/сек.
Часто возникает необходимость быстро прикинуть во сколько раз нужно изменить объемную скорость потока при переходе на колонку другого диаметра. В этом случае можно принять εm для обоих колонок равной. Фактор отклика будет равен квадрату отношения диаметров колонок: (dc1/dc2)2. Например, при переходе с колонки 250х4.6 на колонку 250х2 для сохранения тех же условий анализа объемную скорость потока надо уменьшить в (0.46/0.2)2 = 5.29 раза, к примеру, с 1 мл/мин до 0.190 мл/мин.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. График зависимости Ван-Деемтера. www.chromforum.ru
Рисунок 88. График зависимости Ван-Деемтера
График зависимости Ван-Деемтера приведен на рисунке 88. Видно, что он проходит через минимум. Этот минимум соответствует скорости потока, при которой ВЭТТ минимальна, а удельная эффективность разделения максимальна. Таким образом, если бы основным критерием оптимизации была эффективность, то работать следовало бы именно при оптимальной скорости потока.
Тем не менее, на практике чаще всего работают при скорости потока, в несколько раз превышающей оптимальное значение. Это связано с тем, что сокращение времени анализа приносит больше выгоды, чем сохранение оптимальной эффективности – тем более, что ее потери не столь уж критичны. Обычная, рабочая скорость потока составляет порядка 0.2-0.3 см/сек, что соответствует объемной скорости порядка 0.8-1.5 мл/мин для колонок с диаметром 4.6 мм, или 0.15-0.3 мл/мин для колонок с диаметром 2 мм.
Коэффициенты A, B, C в уравнении Ван-Деемтера отражают физические процессы, протекающие в колонке. Рассмотрим их.
Коэффициент А напрямую связан с качеством заполнения колонки сорбентом (λ) и с размером частиц сорбента dp: A = 2λ*dp, где λ принимает значения между 1 и 2. Чем лучше заполнена колонка сорбентом, тем меньше значение λ.
Коэффициент (осевой) молекулярной диффузии В. В процессе движения зоны компонента вдоль колонки молекулы компонента в результате диффузии отклоняются от центра зоны вдоль оси колонки. На практике можно считать, что размывание происходит только под влиянием продольной диффузии в жидкой фазе. Поскольку стандартное отклонение молекул по закону Эйнштейна пропорционально времени диффузии, эффект молекулярной диффузии сильнее всего проявляется при небольших скоростях потока, когда хроматографируемый компонент находится в колонке в течение продолжительного времени. Коэффициент В связан с коэффициентом диффузии адсорбата в подвижной фазе DM: B = 2γ*DM, где γ принимает значения между 0.6 и 0.8.
Коэффициент С, обусловленный кинетикой процессов массопередачи. При движении хроматографической зоны вдоль колонки молекулы компонента проходят серию актов адсорбции-десорбции. Адсорбированные молекулы можно считать неподвижными, в то время как десорбированные молекулы движутся вместе с потоком элюента. Таким образом, концентрационный профиль вещества в неподвижной фазе (на адсорбенте) всегда отстает от профиля вещества в подвижной фазе (в жидкой фазе). Это явление приводит к уширению хроматографической зоны, причем в прямой зависимости от скорости потока.
Отставание профиля вещества в неподвижной фазе оказывается тем сильнее, чем медленнее происходит перемещение молекул компонента из неподвижной фазы в подвижную, то есть чем хуже происходит массоперенос (массопередача) вещества в хроматографической системе. Кинетика массопередачи определяется двумя факторами:
1. диффузией вещества в подвижной фазе (внешний массообмен);
2. диффузией вещества в неподвижной фазе (внутренний массообмен).
Вклад второго фактора, как правило, является определяющим.
Соответственно, коэффициент С можно представить как сумму двух слагаемых CM и CS:
С = CM + CS = ω*dp2/DM + q*k’/(k’+1)2*(df2/DS), где
DS – коэффициент диффузии адсорбата в неподвижной фазе,
df – средняя величина пробега при диффузии адсорбата в неподвижной фазе,
q – константа со значением около 2/3;
ω – константа со значением от 0.02 до 5.
Как уже было показано, хроматографирование, как правило, ведут на скорости, большей оптимальной. В таких условиях ВЭТТ в основном определяется кинетическим фактором С*u. Соответственно, задача по уменьшению ВЭТТ сводится, по сути, к поиску путей уменьшения влияния кинетического фактора, то есть улучшения массопередачи в хроматографической системе.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Зависимости Ван-Деемтера для силикагельных фаз со средним диаметром частиц 2.7, 5 и 10 мкм. www.chromforum.ru
Рисунок 89. Зависимости Ван-Деемтера для силикагельных фаз со средним диаметром частиц 2.7, 5 и 10 мкм
2.1.2. Гидродинамика ЖХ колонки. Уравнение Дарси
Казалось бы, в погоне за оптимальными условиями разделения можно хоть до бесконечности уменьшать размер частиц адсорбента, а скорость также до бесконечности увеличивать. Тогда удельная эффективность стремилась бы к бесконечности, а время анализа – к нулю (от чего бы все только радовались). Но «деревья не растут до небес». Оба действия – увеличение скорости потока и уменьшение диаметра частиц адсорбента – приводят к увеличению давления в колонке. Вязкую жидкость становится все труднее продавить через трубку, плотно упакованную мелким порошком. Так происходит до тех пор, пока давление не достигнет максимума, который может обеспечить насос.
Зависимость, которая спускает увлеченного оптимизацией хроматографиста с небес на землю, называется уравнением Дарси:
∆P = (u*η*L)/(K°*dp2), где
∆P – перепад давления в колонке, u – скорость потока, η – вязкость элюента, L – длина колонки, K° – коэффициент, называемый проницаемостью колонки, dp – средний диаметр частиц адсорбента.
Смысл этого «вредного» уравнения состоит в том, что применение самых действенных инструментов оптимизации разделения ограничено чисто техническими причинами. При заданном давлении и времени анализа нельзя на практике достичь эффективности, большей некоторой предельной величины. И наоборот, при заданном давлении и эффективности нельзя на практике добиться времени анализа, меньшей некоторой предельной величины.
Вывод: чем-то надо жертвовать. Другое дело, что жертвовать можно неумело и много, а можно и со знанием дела, по минимуму. В этом и состоит искусство оптимизации.
2.1.3. Эволюция ЖХ и ЖХ колонок. Современные тренды в ВЭЖХ
С уравнениями Дарси и Ван-Деемтера в своей работе сталкиваются не только хроматографисты, но и производители хроматографического оборудования и колонок.
Если аналитик должен проводить разделения веществ, то производителю необходимо выводить на рынок продукты, которые требуются аналитику в его работе. Таким образом, тенденции (тренды) развития этих продуктов – будь то хроматографы или колонки – диктуются, прежде всего, существующим спросом. С другой стороны, уровень развития технологий и производственной базы, а также норма прибыли, ограничивают качество предлагаемых товаров. В результате, в каждый момент времени достигается компромисс между текущими запросами хроматографистов и их возможностями расплатиться за качественное техническое решение своих задач.
Для каждого слагаемого успешного технического решения можно выделить свой фактор, ограничивающий развитие. Например, качество и ассортимент адсорбентов напрямую зависят от уровня развития технологий их крупномасштабного синтеза. В свою очередь, технологии требуют инвестиций, которые имеют свойство окупаться только при солидной норме прибыли – которая сильно зависит от объема рынка. Таким образом, становится понятно, почему хорошие адсорбенты для хроматографии стали появляться только тогда, когда ВЭЖХ стала рутинным, массовым аналитическим методом.
История широкого применения жидкостной хроматографии начинается в 60-е годы. По сути, колоночный вариант хроматографии не применяли тогда в целях аналититики – для аналитических разделений существовала ТСХ. Крупные стеклянные колонки, заполненные дробленым отсеянным силикагелем размера 0.1-0.3 мм, применяли для препаративного выделения веществ (к примеру, полупродуктов органического синтеза) в режиме нормально-фазовой хроматографии. Никакой специальной аппаратуры такие препаративные разделения не требовали.
Для перехода колоночной хроматографии к аналитическим применениям требовалась значительно повысить эффективность разделения, доведя ее по крайней мере до 2-3 тысяч т.т. Без специального оборудования и без какого-либо прогресса в технологии производства адсорбентов сделать подобное было непросто. Фактически, основной способ увеличения эффективности заключался в увеличение длины колонки до 50-100 см. Для их заполнения также применяли дробленый, отсеянный на ситах силикагель, но меньших и при этом более узких фракций порядка 50-150 мкм. Ценой увеличения эффективности стало закономерное увеличение времени разделения; оно могло варьироваться от десятков минут до нескольких часов.
Таким образом, для выполнения рутинных аналитических разделений такой вариант не подходил из-за слишком больших временных затрат. Время анализа было необходимо сократить даже не в разы, а на порядок. Сделать это было можно, лишь обеспечив существенно большее давление в системе, то есть применяя насосную систему. Для выполнения точных количественных определений были также необходимы специализированные детектирующие системы.
Все эти условия привели к появлению на рынке жидкостных хроматографов высокого давления. Появившийся запас давления позволил не только увеличить скорость потока до необходимого оптимума, но и сократить длину колонки, компенсируя уменьшение эффективности применением мелких фракций силикагеля. Длина колонок была уменьшена до привычных нам 150-300 мм, а заполнялись они в начале все тем же низкокачественным силикагелем, однако, с меньшим средним размером частиц порядка 10-20 мкм.
В итоге, переход к хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) был большей частью обусловлен необходимостью сокращения времени анализа до уровня, приемлемого для выполнения рутинных анализов. Переход был выполнен за счет внедрения новой техники: насосов высокого давления.
Широкое внедрение ВЭЖХ стало своего рода переломным моментом, повлекшим изменение тренда развития метода. Поскольку скорость выполнения разделения была теперь вполне приемлема, да и запас давления был вполне приличным, все ресурсы были брошены на увеличение эффективности разделения. Это был бум совершенствования технологий синтеза адсорбентов (прежде всего, силикагеля) и технологий набивки колонок.
Начали синтезировать специальный силикагель для ВЭЖХ: сферической формы, небольшого диаметра вплоть до 5 мкм, достаточно узкого фракционного состава. Появились качественные стальные трубки для колонок. Однако, качество фабрично произведенных колонок все еще оставляло желать лучшего: опытный мастер при желании мог изготовить колонку, по характеристикам превосходящую фирменные аналоги.
Параллельно в этот период времени, по причине своей универсальности, все большую и большую популярность приобретала обращенно-фазовая хроматография на С18 силикагелях. Фактически, тренд на увеличение эффективности и универсальности аналитических подходов с использованием ВЭЖХ закончился практически полным доминированием колонок одного типа: типоразмера 250х4.6 с С18 силикагелем фракции 5 мкм. Качество изготовления колонки стало настолько высоким, а ее стоимость настолько низкой, что кустарное производство колонок стало невыгодным. Колонка стала фабричным продуктом; ее эффективность достигла уровня 15-20 тыс. т.т., чего было вполне достаточно для большинства приложений.
Новый, современный этап развития ВЭЖХ начался в 90-х годах; он связан с активным применением жидкостной хроматографии в промышленности, прежде всего – фармацевтической. Важной характеристикой разделения стала производительность, т.е. опять-таки скорость.
В 60-70-е задача увеличения скорости была решена внедрением насосов высокого давления. Подобная попытка, на этот раз со внедрением насосов сверхвысокого давления, была сделана и в 90-е. Итоги пока подводить рано, практика применения сверхвысоких давлений не то чтобы еще не завершилась – по сути, она только началась. Однако, становится вполне очевидо, что простое повышение рабочих давлений уже не способно оказать такого революционного эффекта, как это было в случае внедрения ВЭЖХ. Для этого есть и чисто хроматографические причины (теория хроматографии предсказывает замедление роста ресурса разделения/скорости при повышении давления), так и причины технические и эксплуатационные.
Второе возможное решение задачи увеличения скорости, которое также применялось ранее, заключается в сокращении длины колонки. При этом для сохранения эффективности на прежнем уровне более короткие колонки должны заполняться асорбентом с более мелкими частицами. Именно такой тренд в развитиии ВЭЖХ доминировал в последние два десятилетия. В настоящее время для достаточно простых разделений применяют 100 мм колонки с 3 мкм адсорбентами и 50-75 мм колоноки с 2 мкм адсорбентами.
При равной эффективности двух колонок различной длины с адсорбентами различных фракций, на колонке меньшей длины с мелким адсорбентом перепад давления будет больше, чем на длинной колонке с крупным адсорбентом. По этой причине создается несколько парадоксальная на первый взгляд ситуация, когда для работы на коротких колонках требуются достаточно высокие давления (поскольку современные короткие колонки заполнены мелкими адсорбентами). И здесь мода на повышенные и сверхвысокие давления приходится как раз кстати: при сокращении длины колонки эффективность в полной мере можно сохранить только на фоне возрастающего давления. С этой точки зрения сверхвысокое давление выглядит не как отдельное самостоятельное решение задачи повышения производительности, а, скорее, как один из компонентов решения с применением более коротких колонок.
Еще одним следствием активного применения ВЭЖХ в фармацевтике стал крах монополии С18 силикагеля. Разнообразие фармацевтических и протеомных задач оказалось настолько большим, что одной, пусть даже очень универсальной, неподвижной фазы стало явным образом недостаточно для их решения. По этой причине число различных типов неподвижных фаз в последнее время только растет.
Таблица 7. Изменение трендов в ВЭЖХ с 60-х годов до наших дней
2.1.4. Оптимизация разделения: общий аглоритм
Оптимизация разделения может осуществляться как с целью уменьшения времени, затрачиваемого на разделение (при заданном разрешении критической пары), так и для достижения лучшего разрешения пиков на хроматограмме (при заданном времени анализа). Трендом современной жидкостной хроматографии, безусловно, является сокращение времени анализа в условиях рутинных измерений. Поэтому с самого начала сформулируем задачу оптимизации как сокращение времени анализа при условии сохранении минимально необходимого разрешения критической пары и при фиксированном (доступном пользователю) давлении в жидкостной системе.
Подобного рода оптимизацию проводят в несколько этапов, соблюдая определенный порядок действий:
1. подбирают хроматографические условия с оптимальной селективностью разделения α; регулируют удерживание k’ и фиксируют его оптимальное значение;
2. выделяют критическую пару, определяют оптимальное разрешение критической пары Rmin; определяют минимальную эффективность Nmin, обеспечивающую заданное разрешение Rmin при данной селективности α и удерживании k’);
3. подобрирают типоразмер колонки и скорость потока элюента.
Селективность хроматографической системы является ключевым фактором, влияющим на разделение. Сложность разделения очень быстро уменьшается с ростом селективности; соответственно, удачно подобранная селективность значительно снижает требования к минимальной эффективности, необходимой для обеспечения заданного разрешения.
Заданная селективность, по сути, означает, что выбор хроматографического режима и хроматографической системы (т.е. неподвижная фаза плюс состав подвижной фазы) сделан. Регулирование удерживания k’ на практике означает выбор соотношения компонентов подвижной фазы, при котором целевые вещества попадают (по возможности) в наиболее оптимальный диапазон 2 < k’ < 5 (для колонки 250х4.6 мм при скорости потока 2 мл/мин он примерно соответствует диапазону времен удерживания 4 мин. < tR < 7 мин.).
Если работу ведут строго по методике (на определенном элюенте и на определенной неподвижной фазе), то селективность α и удерживание k’ можно считать уже заданными.
На втором этапе необходимо, во-первых, выделить критическую пару (или критические пары, если их несколько).
Критической парой называется пара пиков, для которых выполняются два основных условия:
1. по крайней мере один из пиков относится к целевому веществу; природа второго пика не принципиальна: это может быть другое целевое вещество, примесь, либо вообще, нередко, системный пик;
2. селективность разделения этих двух веществ невысока, по причине чего разрешение пары пиков оказывается очень чувствительно к небольшим изменениям условий хроматографирования.
Соответственно, при выборе условий хроматографирования, обеспечивающих меньшее время анализа, первым делом от недостаточного разделения будет страдать именно критическая пара. Игнорировать неполное разделение этой пары невозможно, так как речь идет о выделении чистого сигнала целевого вещества. Таким образом, именно разрешение критической пары лимитирует усилия по сокращению времени всего анализа.
Выбирать минимальное разрешение критической пары следует таким образом, чтобы отношение площади перекрывания пиков к площади целевого вещества было меньше допустимой погрешности определения площади пика. В общем случае минимальное разрешение зависит от относительной высоты пиков и их симметрии. Для полностью симметричных пиков равной высоты достаточно строгим требованием является соблюдение разрешения Rmin ≥ 1.2.
Поскольку селективность и удерживание уже зафиксированы, выбор минимального разрешения Rmin автоматически определяет требуемую минимальную эффективность Nmin. Нужно при этом понимать, что речь здесь идет о реальной эффективности, измеренной по самому широкому пику критической пары на реальной хроматограмме – а не о числе теоретических тарелок, взятом из паспорта колонки.
Случается, что начинающие хроматографисты говорят об идеальных разделениях без критических пар. Такого не может быть в принципе: критическая пара есть всегда, иначе время любого анализа равнялось бы нулевому времени. Как правило, видимое отсутствие критических пар говорит либо об очень неоптимальных условиях (время анализа значительно больше того, которого можно было бы достичь в результате оптимизации), либо о том, что первый пик целевого соединения вообще не удерживается – что является простой хроматографической ошибкой. Даже если на хроматограмме есть всего один пик целевого вещества, то его необходимо надежно разделять от системных пиков в районе нулевого времени.
Итак, к выбору типоразмера колонки и скорости потока надо подходить, уже зная:
- хроматографическую систему (неподвижную и подвижную фазы), то есть селективность α и удерживание k’,
- критическую пару, ее минимальное требуемое разрешение Rmin и минимальную необходимую для этого эффективность разделения Nmin,
- также, вообще говоря, надо представлять себе, какое максимальное рабочее давление ∆P мы можем себе позволить при работе на данном хроматографе.
Про максимальное рабочее давление ∆P: создается такое впечатление, что этот параметр больше зависит от психологии человека, чем от каких-то рациональных доводов. В принципе, при верхнем пределе насоса в 400 атм стараются работать при давлении не выше 250-300 атм; для насоса с пределом в 600 атм разумное максимальное давление составляет 400 атм.
Переходим к подбору типоразмера колонки и скорости потока. На этом этапе задача оптимизации будет выглядеть так: предельно сократить время t, обеспечив необходимую минимальную эффективность Nmin и уложившись в максимально возможное давление ∆P. Единственный ресурс, которым мы обладаем – это запас по давлению, то есть ∆P. Последние параметры, которыми мы можем оперировать: размер частиц адсорбента dp, длина колонки L и скорость потока u.
Можно составить всего три комбинации действий, которые приведут к ускорению анализа при фиксированной эффективности. Привожу их в порядке увеличения потребления ресурса – запаса по давлению:
1. надо уменьшать длину колонки и одновременно уменьшать диаметр частиц адсорбента;
2. надо увеличивать скорость потока и умеренно увеличивать длину колонки;
3. надо увеличивать скорость потока и умеренно уменьшать диаметр частиц адсорбента.
Недостаток первого способа состоит в том, что разрешение критических пар с невысоким удерживанием при сокращении длины колонки будет в реальности падать, причем невзирая на формально фиксированную эффективность. Это связано с негативным влиянием таких факторов, как экстраколочные объемы. По этой причине первый способ применяют либо в том случае, когда критические пары обладают значительным удерживанием, либо когда на практике есть некоторый запас по разрешению. Более того, при наличии значительного запаса по разрешению в первую очередь применяют именно этот способ сокращения времени анализа.
Второй или третий способы, соответственно, применяют, когда существенного запаса по разрешению нет, а удерживание критических пар невелико.
Чтобы непосредственно ощутить процесс оптимизации, предлагаю перейти от теории к двум очень простым практическим примерам. Рассмотрим пару пиков. В первом примере разрешение будет предельно допустимо малым, и поэтому фиксированным. Во втором примере разрешение с самого начала будет достаточно большим, и мы сможем использовать его запас как дополнительный ресурс.
Пример 1. Мы получили хорошее разрешение критической пары (Rs = 1.2) на колонке 250х4.6 с 5 мкм адсорбентом при скорости 1 мл/мин при комнатной температуре за 15 минут и давлении 100 атм. Запаса по разрешению, как уже было сказано, у нас нет. Как можно сократить время анализа?
Сократим длину колонки до 150 мм, а потерю эффективности компенсируем тем, что возьмем колонку с 3 мкм адсорбентом. Получим то же разделение, но за 9 минут. Кстати, при этом высота пика и, соответственно, отношение сигнал/шум увеличатся в 2 раза (за счет уменьшения разбавления). Немного подрастет давление, но не слишком сильно.
Для 3 мкм адсорбента коэффициент С в уравнении Ван-Деемтера значительно меньше, чем для 5 мкм, поскольку с случае 3 мкм адсорбента массопередача происходит быстрее. Это значит, что скорость потока можно увеличивать в определенных рамках вообще практически без потери эффективности. Увеличим скорость потока до 1.5 мл/мин, а колонку будем термостатировать при 40°С. Давление, которое при комнатной температуре могло подняться и до 250 атм, при 40°С будет находиться в пределах 200 атм (по причине уменьшившейся вязкости элюента). Эффективность ничуть не пострадает. А вот время анализа будет составлять уже 6 минут.
Боюсь, что при изначальном отсутствии запаса по разрешению величину 6 минут уже не уменьшить. Конечно, применяя новейшие адсорбенты при тщательно подобранных условиях, все-таки можно подвинуть ее еще немного, минут до 4-3. Но, в принципе, результат и так неплох: производительность анализа практически на ровном месте удалось увеличить втрое.
Пример 2. Теперь пусть запас по разрешению будет достаточно большим, например, Rs = 2.5. Возможностей – масса! Для начала, от колонки длиной 150 мм перейдем на колонку длиной 50 мм (все колонки с 3 мкм адсорбентом). Это уже приведет к сокращению времени анализа от 6 минут до 2 минут. Но запас еще будет – и по эффективности (разрешение будет составлять порядка Rs ≈ 1.45), и по давлению (∆P ≈ 70 атм). Можно увеличить скорость потока вдвое, то есть до 3 мл/мин. Время анализа тогда составит 1 минуту.
Проводя этот небольшой умственный эксперимент, я руководствовался определенной целью, и сейчас она станет ясна. К чему мы пришли в итоге эксперимента? К тому, что без запаса по разрешению увеличили производительность анализа в 3 раза, а с запасом по разрешению – в 15 раз.
На разрешение же критично влияет селективность α. Даже при небольшом увеличении α разрешение может увеличиться в разы, а производительность анализа, в чем мы уже могли убедиться, даже на порядок. Поэтому искусством в хроматографии является, прежде всего, управление селективностью. При этом, оптимизация разделения при заданной селективности является достаточно несложной техникой.
2.1.5. Оптимизация разделения: принципы выбора длины колонки и размера частиц адсорбента
Подход к оптимизации с определением α, k’, Rmin и Nmin, приведенный выше, оказывается удобен в тех случаях, когда с точки зрения скорости анализа оптимизируют уже существующее конкретное разделение. Но описанная процедура не дает ясного представления о принципе выбора длины колонки и размера частиц адсорбента для произвольного хроматографического разделения. В идеальном варианте такой принцип должен выражаться в виде простого правила, либо графика, либо таблицы. Попробуем сформулировать его, исходя из известных нам закономерностей.
Как мы установили в предыдущей главе, в данной хроматографической системе (при фиксированных α и k’) для уменьшения времени анализа мы можем использовать только два ресурса: запас по разрешению и запас по давлению. Фактически, это означает, что давление ∆P, разрешение R и время анализа t должны быть связаны одним соотношением, чтобы при трех переменных оставались две степени свободы. Найдем это соотношение. Подставляя в уравнение Дарси выражение для скорости потока u = L*(1 + k’)/t, а также используя эмпирическую зависимость ВЭТТ от диаметра частицы адсорбента L/N = H ≈ 2*dp, получаем:
∆P ~ (L/dp)2/t ~ N2/t ~ R4/t.
Выражение ∆P ~ R4/t в явном виде показывает, что запас по давлению задает отношение разрешения к времени анализа. Ресурс давления можно увеличить как выбирая более мощную насосную систему (с более высоким предельным давлением), так и уменьшая вязкость подвижной фазы (например, увеличивая температуру, или применяя растворители с подобной элюирующей силой, но меньшей вязкостью).
Таким образом, искомое правило выбора типоразмера колонки можно проиллюстрировать в виде таблицы, столбцы которой соответствуют максимальному рабочему давлению (которое определяется отношением максимального давления насосной системы к вязкости подвижной фазы при данной линейной скорости потока), а строки – оптимальному для данного разделения балансу (компромиссу) между разрешением и временем анализа - см. табл. 8.
Баланс между разрешением и временем анализа – это и есть наиболее интересный вопрос. Ведь из теории следует, что мы можем уменьшать длину колонки, сохраняя заданную эффективность, хоть до нуля, стремясь к бесконечной скорости анализа. Так почему же тогда 150-250 мм колонки так часто применяются в ВЭЖХ, причем очень неохотно уступают свои позиции? Что же сдерживает наше желание купить менее длинную колонку?
Дело в том, что требования, которые мы в реальности предъявляем к ВЭЖХ системе и, в частности, к конкретному разделению, на практике оказываются значительно шире, чем просто требования к качеству разделения. Я бы выделил по крайней мере три основные фактора.
Начнем, однако, с четвертого, значение которого сейчас уже не очень велико, но было весьма значительно раньше. Это технологии производства адсорбентов для ВЭЖХ и упаковки ВЭЖХ колонок. Раньше они были примитивнее, и просто не позволяли добиться изготовления качественных коммерческих колонок короче 100 мм и частицами менее 3 мкм – и это в 80-90-х годах! Таким образом, выбор более короткой колонки был ограничен уровнем развития технологий производства колонок.
Теперь о факторах, которые зависят от технологий в меньшей степени. Как мы уже заметили в предыдущей главе, при сокращении длины колонки разрешение критических пар падает даже при фиксированной формальной эффективности. Этот эффект сильнее наблюдается для слабо удерживаемых критических пар, и обусловлен негативным влиянием экстраколоночных объемов. То есть сокращению времени анализа за счет уменьшения длины колонки в первую очередь мешают критические пары в начале хроматограммы. Соответственно также, этот фактор не имеет никакой силы в том случае, если целевое вещество всего одно (мы можем отрегулировать его удерживание так, как нам нужно).
Конечно же, экстраколоночные объемы можно минимизировать. Тем не менее, на практике, кроме некоторого роста затрат на оборудование и расходные материалы, эта работа неизбежно приведет к тому, что применяемая ВЭЖХ система потеряет свою многофункциональность. Скурпулезно "заточенную" под конкретный анализ ВЭЖХ систему будет уже просто неудобно применять для других анализов: слишком много трудозатрат потребует ее переконфигурирование. Но главный минус – соответствующую методику будет сложно воспроизвести в другой лаборатории, если аналитики не обладают там такими же глубокими познаниями в области конструирования ВЭЖХ систем и борьбы с экстраколоночными объемами.
Наконец, существует фактор, не просто ограничивающий стремление сокращать длину колонки, а заставляющий соблюдать значительный запас по разрешению, причем – что совсем ужасно – особенно в начальной части хроматограммы. ВЭЖХ систему с конкретным выполняемым разделением могут рассматривать как анализатор. В этом случае автоматически предполагают, что разделению могут помешать пики заранее неизвестных соединений, вероятность появления которых максимальна в начальной части хроматограммы. Иначе говоря, сложность разделения предполагается значительно более высокой, чем это следует из базового разделения целевых веществ (и, возможно, основных примесей или компонентов матрицы). Соответственно, между пиками должно быть достаточно "места", чтобы они там "разместились", то есть существенный запас по разрешению позволяет снизить вероятность коэлюирования неизвестного контаминанта и целевого вещества.
Таблица 8. Зависимость оптимального диаметра полностью пористых частиц ВЭЖХ адсорбента dp от предела давления насосной системы, вязкости элюента и длины колонки. В указанных условиях оптимальная объемная скорость потока для обращенно-фазового режима составляет порядка 2 мл/мин (для колонок диаметра 4.6)
2.1.6. Оптимизация разделения: принципы выбора диаметра колонки
Вообще говоря, выбор диаметра колонки напрямую не связан с задачей оптимизации разделения. Колонки меньшего диаметра требуют меньших затрат: как элюента (следовательно, и недешевых растворителей высокой чистоты), так и пробы (что становится существенным, если объем пробы мал и/или проба также недешева). Колонки большего диаметра менее чувствительны к экстраколоночным объемам (сюда входят: соединения жидкостной системы, объем пробы, объем кюветы детектора) и составу растворителя для ввода пробы.
Таким образом, колонки небольшого диаметра (микроколонки) более экономны, но требуют от хроматографического разделения повышенной надежности (робастности). Как мы выяснили в предыдущей главе, требование высокой надежности разделения, особенного сложного, значительно ограничивает производительность анализа. По этой причине быстрые разделения гораздо более практично проводить на колонках большего диаметра – тем более, что быстрые разделения проводят на коротких, в достаточной мере экономных колонках.
Основной областью применения микроколонок (с диаметром 1-2 мм) и капиллярных колонок (с диаметром 0.15-0.3 мм) является ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Снижение объема подаваемого в детектор элюата благоприятно сказывается на процессе ионизации, что приводит к увеличению чувствительности детектирования.
При проведении разделений в градиентном режиме элюирования аналитические колонки уменьшенного диаметра (3 мм) можно успешно применять даже на коротких колонках, поскольку негативное влияние экстраколоночных объемов при градиентном элюировании сведено к минимуму за счет концентрирования хроматографических зон. В изократическом режиме диаметр 3 мм лучше сочетается с достаточно длинными колонками. Основная идея применения колонок диаметра 3 мм – это экономия элюента, примерно двукратная по сравнению с аналитическими колонками диаметра 4-4.6 мм.
Быстрые изократические разделения удобнее проводить на коротких аналитических колонках диаметра 4-4.6 мм.
Таблица 9. Критерии выбора диаметра ВЭЖХ колонки
2.1.7. Регулирование основных параметров хроматографического анализа
2.1.7.1. Способы увеличения эффективности разделения
Вначале разберем способы увеличения эффективности разделения.
Уменьшение среднего диаметра частиц адсорбента dp. Безусловно, наиболее действенным способом увеличения эффективности колонки является выбор колонки, упакованной адсорбентом с меньшим диаметром частиц. При уменьшении dp в 2 раза удельная эффективность увеличится примерно в dp1.5 = 21.5 ≈ 2.83 раза, а разрешение, соответственно, в √2.83 ≈ 1.7 раз.
Давление, однако, при этом возрастет в четыре раза: перепад давления обратно пропорционален квадрату диаметра частиц ∆P ~ 1/dp2. К примеру, при переходе от 15 см колонки с 6 мкм адсорбентом на колонку с такой же длиной, но с 3 мкм адсорбентом (dp уменьшается вдвое) эффективность увеличивается примерно с 7000 до 20000 т.т. (то есть эффективность возрастает примерно втрое, а разрешение в 1.7 раз); при этом давление может увеличиться от 50 атм до 200 атм.
Увеличение длины колонки L. Эффективность можно пропорционально увеличить за счет увеличения длины колонки N ~ L. Допустим, колонка длиной 15 см имеет эффективность 15000 т.т. Удельная эффективность упаковки составляет 15000 т.т./0.15 м = 100000 т.т./м. Соответственно, колонка длиной 25 см будет иметь эффективность порядка 100000 т.т./м*0.25 м = 25000 т.т.
Пропорционально длине будет увеличиваться и давление ∆P ~ L. Казалось бы, эта ситуация лучше, чем в первом случае, где давление при уменьшении dp возрастало квадратично. Однако, увеличение длины колонки влечет за собой пропорциональное увеличение времени анализа, поскольку t ~ L/u. Чтобы компенсировать потерю времени, можно увеличить скорость потока u. Но увеличение скорости потока приведет к дальнейшему росту давления.
Таким образом, если зафиксировать время анализа, то давление все равно возрастет квадратично, поскольку ∆P ~ L*u. Эффективность, к тому же, будет увеличиваться не точно пропорционально длине, а немного меньше – из-за ухудшения массопередачи.
Увеличение температуры T. Коэффициент С в уравнении Ван-Деемтера, отвечающий за скорость массопередачи, можно уменьшить путем увеличения температуры Т, что приведет к увеличению эффективности. Увеличение температуры оказывает заметное влияние на эффективность лишь в тех случаях, когда массопередача изначально является довольно медленной: при применении полимерных, углеродных адсорбентов, или адсорбентов с крупными частицами dp > 5 мкм.
В случае применения силикагельных адсорбентов с диаметром частиц 5 мкм и менее увеличение температуры является, скорее, способом сокращения времени анализа (см. далее).
Уменьшение скорости потока u до величины, соответствующей минимуму ВЭТТ на зависимости Ван-Деемтера. Опять же, этот вариант можно рассматривать только в том случае, если массопередача является замедленной в принципе. На практике, как правило, стараются поступать наоборот – увеличивать скорость, жертвуя частью эффективности ради уменьшения времени анализа.
Снижение потерь эффективности, вызванных замедленной кинетикой адсорбции-десорбции. Нередко эффективность, рассчитанная по пику компонента, оказывается значительно ниже эффективности, полученной по пику модельного, нейтрального и неполярного соединения. Уширение хроматографического пика может быть связано с замедленной кинетикой адсорбции-десорбции. Рекомендации по снижению потерь эффективности, вызванных замедленной кинетикой адсорбции-десорбции, приведены в главе П1.1.
Снижение потерь эффективности, вызванных экстраколоночными объемами. Внеколоночные элементы жидкостной системы – экстраколоночные объемы – вносят свой вклад в размывание хроматографического пика. Рекомендации по снижению потерь эффективности, вызванных экстраколоночными объемами, приведены в главе П1.1.
2.1.7.2. Способы сокращения времени анализа
Выразим время анализа через длину колонки L, линейную скорость потока u и фактор удерживания последнего компонента k’:
t = t0*(1+k’) = L*(1+k’)/u.
Из уравнения видно, что время анализа можно сократить, уменьшая длину колонки, увеличивая скорость потока, а также уменьшая удерживание компонентов.
Уменьшение длины колонки L. Время анализа сокращается пропорционально уменьшению длины хроматографической колонки t ~ L. Ценой является такая же пропорциональная потеря эффективности N ~ L.
С счастью, перепад давления при этом также уменьшается ∆P ~ L. Образовавшийся запас по давлению можно использовать двумя путями:
- еще сильнее сократить время анализа,
- компенсировать потери эффективности.
В первом случае необходимо дополнительно увеличить скорость потока. В результате, давление остается на прежнем уровне ∆P ~ L*u, a время анализа дополнительно сокращается, поскольку t ~ L/u. Таким образом, при фиксированном давлении уменьшение длины колонки вдвое приведет к сокращению время анализа в 4 раза. Правда, потеря эффективности составит более двух раз.
Во втором случае для компенсации потери эффективности следует взять колонку, заполненную более мелким адсорбентомц. Так, эффективность колонки с L = 150 мм и 3 мкм адсорбентом практически равна эффективности колонки с L = 250 мм и 5 мкм адсорбентом, при том, что при работе на 150 мм колонке разделение занимает в два раза меньше времени.
Увеличение скорости потока u. Увеличение скорости потока приводит к пропорциональному сокращению времени анализа: t ~ 1/u.
При этом, если зафиксировать длину колонки, перепад давления будет увеличиваться так же пропорционально ∆P ~ u. Кроме того, при увеличении скорости уменьшается эффективность, что особенно заметно для адсорбентов с крупными частицами (порядка 5 мкм и более) и/или замедленной кинетикой адсорбции-десорбции.
До определенного предела сдерживать рост давления можно путем снижения вязкости элюента – за счет увеличения температуры ∆P ~ u*η(T). Высвобождаемый в результате повышения температуры запас по давлению можно использовать для оптимизации разделения. К примеру, запас по давлению позволяет улучшить разрешение, но в большинстве случаев разделение все-таки оптимизируют в направлении уменьшения времени анализа. Для этого снижают элюирующую силу подвижной фазы (для компенсации снижения удерживания из-за повышения температуры) и увеличивают скорость потока, полностью выбирая образовавшийся запас по давлению.
Вообще говоря, увеличение температуры изменяет саму хроматографическую систему; об этом надо помнить, сокращая время анализа путем одновременного повышения скорости потока и температуры. Здесь самое непредсказуемое и поэтому неприятное – это возможная зависимость селективности разделения от температуры. Вид хроматограммы при повышении температуры может серьезно измениться. Особенно хорошо это бывает заметно в тех случаях, когда механизм удерживания является смешанным.
Еще одно ограничение при повышении температуры касается устойчивости неподвижных фаз. Выше 50°С, к примеру, процесс гидролиза силикагеля заметно ускоряется, что начинает сказываться на времени жизни колонки. Одним словом, для силикагеля рабочая температура 50-60°С является разумным пределом. Полимерные, углеродные адсорбенты могут выдерживать и большие температуры, до 200°С.
Последнее ограничение связано с температурой кипения компонентов элюента: градусов за двадцать-тридцать до точки кипения начинаются проблемы с детектированием. Давление в кювете детектора невелико, 1-2 атм, так что при определенной температуре в ней начинают возникать пузырьки газовой фазы. На хроматограмме это выглядит как резкие пиковые броски базовой линии вверх-вниз. С этим явлением отчасти можно бороться, соединяя капилляр для слива элюата со специальным уплотнительным винтом, противодавлением, который "подпирает" поток элюата и держит давление в ячейке детектора на уровне 2-3 атм.
Уменьшение удерживания k’. Наконец, уменьшение удерживания компонентов может быть самостоятельным инструментом сокращения времени анализа. Однако, сама возможность уменьшать удерживание без последствий для разделения является признаком того, что удерживание изначально было не отрегулировано.
Удерживание не должно быть ни слишком большим, ни слишком малым. Целевые соединения должны по возможности элюироваться в оптимальном диапазоне 2 < k’ < 4, если их одно-два, или в диапазоне 2 < k’ < 10, если их несколько.
2.1.7.3. Способы повышения чувствительности анализа (уменьшения предела определения целевых соединений)
Одной из задач оптимизации, особенно актуальной при определении следовых количеств веществ, является увеличение чувствительности аналитического метода к целевым веществам, т.е. снижение предела их определения. В общем виде эта задача выходит за рамки оптимизации хроматографического разделения.
Существует четыре группы параметров, влияющих на величину сигнала целевых веществ; они связаны:
- с пробой (концентрация целевого вещества в пробе, ее вводимый объем);
- с хроматографическим разделением (разбавление пробы в результате элюирования);
- с детектированием (у каждого детектора есть набор настраиваемых параметров, оказывающих влияние на чувствительность);
- с обработкой хроматографических данных (применение различных численных фильтров сигнала детектора).
Для отношения сигнал/шум можно записать следующее формальное определение:
SN = h/Z = F*Cmax/Z = (F*Cпр)/(D*Z), где
SN – отношение сигнал/шум,
h – высота пика,
Z – высота шума,
F – чувствительность детектора по данному веществу,
Cmax – максимальная концентрация компонента в хроматографической зоне (в пике),
Cпр – концентрация компонента в пробе,
D – разбавление. Эта величина показывает, во сколько раз максимальная концентрация компонента в пике меньше концентрации компонента в пробе D = Cmax/Cпр.
Здесь параметры, связанные с пробой, заложены с Cпр и частично в D (объем пробы). Параметры, связанные с хроматографическим разделением, заложены в D (кроме объема пробы). Параметры, связанные с детектированием, заложены в F и Z, а параметры, связанные с обработкой хроматографических данных – в Z.
Прежде чем обсуждать собственно оптимизацию хроматографического разделения, т.е. пути уменьшения разбавления D, вкратце прокомментируем другие способы увеличения чувствительности аналитического метода.
При условии идеально функционирующего прибора вряд ли можно повлиять на чувствительность F и шумы детектора Z существенным образом. Для спектрофотометра, к примеру, увеличить сигнал можно выставлением большей ширины спектральной щели; при этом, однако, будет уменьшаться монохроматичность излучения и, соответственно, специфичность детектирования. Шумы можно уменьшить, выставив большую постоянную времени. Ценой будет являться уменьшение количества измеряемых точек в единицу времени и, соответственно, ухудшение воспроизводимости площади наиболее узких пиков.
Совсем другое дело, если речь идет о неисправностях детектора, или погрешностях работы всего пробора вцелом: в такой ситуации отношение сигнал/шум может значительно уменьшиться – что потребует устранения всех неполадок.
Умеренный эффект на снижение уровня шумов оказывают и численные фильтры.
Наибольшее влияние на отношение сигнал/шум оказывает увеличение полезного сигнала за счет оптимизации параметров, связанных с пробой. Фактически, речь идет об увеличении концентрации целевых веществ в пробе SN ~ Cпр и об увеличении объема вводимой пробы SN ~ Vпр (формально этот параметр входит в параметр разбавления D).
Если пробу получают растворением твердого образца, то для увеличения Cпр необходимо в меньшем объеме жидкости растворить больше образца (либо упарить из раствора образца больше растворителя). Основные сложности здесь связаны с ограниченной растворимостью – либо непосредственно целевого вещества, либо компонентов комплексного образца, включающего целевое вещество.
Нередко применяемый элюент, оптимальный в качестве растворителя пробы с точки зрения эффективности разделения, оказывается плохим растворителем образца фактически. И наоборот: растворитель, оптимальный с точки зрения собственно растворения образца, оказывается плохо совместимым с применяемым хроматографическим режимом. В подобных случаях, если чувствительность определения явно недостаточна, бывает необходимо полностью изменить условия хроматографического анализа.
Если проба является продуктом пробоподготовки, Cпр можно повысить путем концентрирования пробы, например, методом ТФЭ. Когда пробоподготовка включает отгонку растворителя, даже очистка пробы позволяет увеличить Cпр: чем меньше в пробе компонентов матрицы, тем в меньшем объеме растворителя возможно приготовить пробу.
Все перечисленные методы увеличения вводимого в хроматограф количества целевого вещества n = Cпр*Vпр (т.е. это касается и концентрации в пробе, и объема вводимой пробы) имеют одно ограничение. При определенном введенном в колонку количестве вещества происходит перегруз колонки (column overload). Хроматографическая колонка обладает вполне определенной емкостью по веществу, то есть физически не может адсорбировать больше определенного количества вещества. При перегрузе колонки хроматографические пики уширяются (то есть уменьшается эффективность разделения) и становятся асимметричными. При перегрузе также уменьшаются времена удерживания.
Устойчивость колонки к перегрузу определяется в первую очередь количеством адсорбента в сечении колонки и емкостью адсорбента. Емкость по определенному веществу определяется как максимальное количество адсорбированного вещества на единицу массы адсорбента. На колонку можно нанести тем больше количества вещества n = Cпр*Vпр, чем больше квадрат диаметра колонки dc2 и больше емкость адсорбента. Бывает так, что сравнительно невысокая емкость адсорбента накладывает серьезное ограничение на n: так, на обращенную фазу С18 в ОФ режиме можно нанести лишь примерно десятую часть того количества вещества, которое выдержала бы фаза с немодифицированным силикагелем в НФ режиме.
Чисто хроматографический подход к увеличению отношения сигнал/шум состоит в уменьшении разбавления пробы в хроматографической колонке SN ~ 1/D. Разбавление можно представить как:
D = (2.5*VR)/(Vпр*√N) ~ (dc2/Vпр)*(1+k’)*√L*√H, где
Vпр – объем вводимой пробы,
VR – объем удерживания,
H – высота теоретической тарелки, ВЭТТ,
dc – диаметр колонки,
L – длина колонки.
Множитель квадрата диаметра колонки dc2 скомбинирован здесь с объемом пробы (dc2/Vпр) не случайно. Нередко ошибочно полагают, что эффективным средством уменьшения разбавления является снижение диаметра колонки, т.е. применение микроколонок. Это не вполне соответствует действительности, учитывая, что уменьшение диаметра колонки подразумевает такое же квадратичное сокращение объема вводимой пробы. Таким образом, в результате точного масштабирования разделения множитель (dc2/Vпр) остается неизменным, ровно как и разбавление D.
Если хотят подобным экстенсивным методом уменьшить разбавление, то, как правило, увеличивают объем пробы Vпр, оставляя диаметр колонки неизменным.
Недостаток этого метода заключается в том, что при введении значительного объема пробы теряется эффективность разделения, поскольку влияние объема пробы на эффективность подобно влиянию экстраколоночных объемов. Это становится особенно хорошо заметно при применении микроколонок, в то время как аналитичекие колонки более устойчивы к вводу больших объемов пробы.
Оптимальный объем пробы для колонок диаметром 4.6 мм и длиной 250 мм в изократическом режиме составляет 20 мкл, но в случае необходимости, при вводе пробы в элюенте, можно поднять ее объем и до 100 мкл.
Одним из приемов для ввода пробы большого объема является применение градиентного элюирования. Речь, фактически, идет об он-лайн ТФЭ без использования специального концентрирующего картриджа – концентрирование происходит прямо на колонке. В этом случае профиль градиента характеризуется быстрым подъемом в начале элюирования, смысл которого заключается в концентрировании пробы, введенной в колоноку, в достаточно узкую хроматографическую зону. После резкого подъема уже можно проводить изократическое элюирование.
Элюирующая сила растворителя пробы должна быть ниже, чем у основной подвижной фазы, т.е. должна соответствовать первой, слабой ступени градиента. К примеру, в обращенно-фазовых условиях, если подвижная фаза содержит порядка 20-30% ацетонитрила, значительный объем пробы можно ввести в том случае, если проба приготовлена в воде (или водном буферном растворе). Первой ступенью градиента также должна быть вода или водный буферный раствор. Таким способом на колонку типоразмера 240х4.6 можно ввести до 1 мл пробы.
Выбор менее длинной колонки с более мелким адсорбентом. Согласно приведенной зависимости для D, разбавление уменьшится, если разделение проводить на менее длинной колонке с более мелким адсорбентом D ~ √L*√H. Так, при переходе от колонки 250х4.6, заполненной адсорбентом зернением 5 мкм, к колонке 150х4.6 с адсорбентом зернением 3 мкм разбавление уменьшается примерно в 2 раза.
Уменьшение удерживания k’. Удерживание компонентов можно уменьшить, что для сильно удерживаемых компонентов приведет к практически пропорциональному сокращению времени анализа t ~ (1+k’) и, соответственно, разбавления D ~ (1+k’). Все минусы этого подхода уже были перечислены выше, на примере уменьшения времени анализа.
