Нормально-фазовая хроматографическая система состоит из полярной неподвижной фазы (НФ) и неполярной подвижной фазы (ПФ). В качестве подвижной фазы в нормально-фазовой хроматографии применяются системы, состоящие из алифатического углеводорода, наример, гексана (основы), и смешивающегося с ним полярного органического растворителя (полярной добавки). Нередко в подвижную фазу добавляют небольшую долю третьего компонента, растворителя высокой полярности, который называется модификатором. Элюирующая сила ПФ возрастает с увеличением доли полярного органического растворителя.
Весьма удачный элюотропный ряд РN для НФ ВЭЖХ был разработан О.Б. Рудаковым (см. табл. 13). Тем не менее, надо хорошо понимать, что даже этот ряд отражает реальную элюирующую силу растворителя в каждом конкретном разделении лишь очень приблизительно.
Таблица 13. Элюотропный ряд РN для нормально-фазовой хроматографии
На это есть две основные причины. Для того, чтобы их сформулировать, необходимо сначала рассмотреть модель нормально-фазовой хроматографии. Удачная "диполь-полевая" модель была предложена С.Н. Сычевым. В этой модели адсорбент считается изначально адсорбционно модифицированным. Поверхность адсорбента, покрытая слоем молекул модификатора с постоянным дипольным моментом, рассматривается как пластина заряженного конденсатора. Энергия адсорбции молекулы с дипольным моментом μ равна потенцальной энергии взаимодействия диполя с полем адсорбента напряженности E:
Еадс. = - μ * E
Напряженность электрического поля полярной адсорбционно модифицированной неподвижной фазы составляет величину порядка 109 В/м, а энергия диполь-полевого взаимодействия – порядка кДж/моль. Данная модель отлично описывает адсорбционное поведение соединений умеренной полярности, которые не способны вытеснять с поверхности молекулы модификатора и встраиваться в адсорбционный слой. Для таких соединений удерживание однозначно определяется дипольным моментом их сольватного комплекса с молекулами полярной добавки. Удерживание, аппроксимированное к нулевой объемной доле полярной добавки, отлично коррелирует с дипольными моментами соединений, определенными стандартными, нехроматографическими методами.
Теперь вернемся к двум причинам, по которым для нормально-фазового режима нельзя составить единственно вероного элюотропного ряда растворителей.
Первая причина. Вид элюотропного ряда будет значительным образом зависеть от наличия или отсутствия добавки модификатора в подвижной фазе. Ряд РN соответствует ситуации уже адсорбционно-модифицированного адсорбента. Эта ситуация, как правило, как раз и встречается на практике. Но в течение долгого времени хроматографисты пользовались другим рядом εº(SiO2), предложенным Снайдером (см. табл. 14).
εº(SiO2) определяется как энергия адсорбции растворителя, отнесенная к площади адсорбента, занятой растворителем. Модель Снайдера описывает вытеснение адсорбатов полярной добавки с поверхности немодифицированного полярного адсорбента. На практике, надо сказать, такие случаи встречаются редко.
При сравнении рядов РN и εº(SiO2) выясняется любопытный факт: элюирующая сила триэтиламина и уксусной кислоты по εº(SiO2) получается значительно выше, чем по РN. Эти вещества по своему действию являются выраженными модификаторами, то есть хорошо связываются с полярным адсорбентом, то время как в ситуации уже адсорбционно модифицированной поверхности их элюирующая сила оказывается умеренной. Таким образом, εº(SiO2) является, скорее, не элюотропным рядом, а рядом модифицирующей способности растворителей.
Таблица 14. Элюотропный ряд εº(SiO2) для нормально-фазовой хроматографии
Вторая причина. Допустим, что в условиях адсорбционного модифицирования удерживание определяется исключительно дипольным моментом сольватного комплекса адсорбата с полярной добавкой. По сути, это утверждение означает, что элюирующая сила растворителя обусловлена ни чем иным как его способностью к сольватированию адсорбата. Уже на этом этапе становится понятно, что, поскольку адсорбатами могут являться различные соединения, которые могут по-разному сольватироваться одним и тем же растворителем – элюирующая сила растворителя неизбежно будет зависеть от химической природы адсорбата.
Например, для адсорбата фенола повышенной относительно РN элюирующей силой будут обладать спирты, поскольку фенол хорошо ассоциируются со спиртами за счет сильных водородных связей. Для адсорбата бензойной кислоты повышенной элюирующей силой будет обладать уксусная кислота, поскольку карбоновые кислоты образуют прочные димеры (сольватные комплексы 1:1).
Ряд РN, таким образом, прежде всего хорош как некоторый средневзвешенный по всем возможным адсорбатам, наиболее универсальный критерий элюирующей силы для НФ систем.
Для оценки удерживания соединений в нормально-фазовых условиях применяется понятие полярности. Чем полярнее соединение, тем сильнее оно удерживается в НФ системах, поскольку сильнее взаимодействует с полярным адсорбентом, чем с неполярным элюентом. Как мы успели убедиться, для среднеполярных соединений свойство полярности можно соотнести с дипольным моментом молекулы или молекулярного комплекса.
Для сильнополярных веществ ситуация выглядит значительно более сложной. Полярность как мера удерживания в НФ системах не подчиняется никаким аддитивным схемам, т.е. приписать той или иной функциональной группе определенный численный инкремент полярности невозможно. Именно поэтому предсказать адсорбционное поведение адсорбата в нормально-фазовых условиях по его структурной формуле очень сложно.
Все же, в грубом приближении, функциональные группы можно расположить в следующий ряд в порядке увеличения их полярности:
-Cl, -Br < -Ar < -OR < -NO2 < -COOR < =C(O) < -COOH* < -NH2*, -OH < -CN < -NHC(O)R* << -SO3H*
Звездочкой отмечены те функциональные группы, которые способны образовывать сильные водородные связи. Если такая группа является единственной полярной группой в соединении, то ее полярность в целом соответствует ее положению в приведенном ряду. Например, удерживание на силикагеле при применении элюента «гексан-уксусная кислота» возрастает в ряду бензол < хлорбензол (-Cl) < нитробензол (-NO2) < бензойная кислота (-COOH) < фенол (-OH).
Но наличие второй полярной, и при этом протон-донорной, группы в дополнение к первой приведет к очень резкому, нелинейному росту полярности. Все будет зависеть еще и от положения функциональных групп. Так, гидроксибензойные и аминобензойные кислоты, где группы -COOH, -OH, -NH2 являются заместителями в бензольном кольце, в принципе, еще можно элюировать в нормально-фазовых условиях, применяя элюенты с высокой долей полярной добавки. Но ни миндальную кислоту, ни фенилаланин , где -COOH, -OH, -NH2 группы находятся в алифатической цепи, в классических нормально-фазовых условиях элюировать не получится – они слишком полярны. Эти соединения даже не растворятся в неполярном элюенте. Для их разделения необходимы условия гидрофильной хроматографии c водноорганическими элюентами.
Таким образом, в условиях классической нормально-фазовой хроматографии определяют только соединения умеренной полярности, что значительно ограничивает универсальность метода.
В предыдущей главе было показано, что в обращенно-фазовой хроматографии селективность разделения достаточно устойчива, ее нелегко изменить. В зависимости от ситуации, это можно рассматривать и как преимущество, и как недостаток метода. Подобная дилемма существует и для нормально-фазовой хроматографии – с тем лишь исключением, что селективность разделения, напротив, изменяется здесь довольно легко. Другими словами, НФ системы являются гибкими (flexible).
Положительный момент состоит в том, что селективностью можно управлять, целенаправленно изменяя состав подвижной фазы или тип неподвижной фазы, тем самым добиваясь оптимального разделения. Негативный момент заключается в том, что освоить эту науку (и где-то даже искусство) не очень-то просто.
Рассмотрим наиболее действенные рецепты для резкого и плавного изменения селективности. Начнем с неподвижных фаз. Наиболее распространены три типа адсорбентов для НФ ВЭЖХ: силикагель, аминопропилированный силикагель (аминофаза, NH2) и цианопропилированный силикагель (нитрильная фаза, цианофаза, CN). Силикагель и аминофаза близки по своим свойствам; нитрильная фаза достаточно сильно от них отличается (см. рис. 96). Этим можно пользоваться: если на силикагеле достичь приемлемого разделения не удается – силикагель можно попытаться заменить нитрильной фазой. Нередко такое решение приводит к успеху, особенно в тех случаях, когда адсорбаты являются апротонными веществами с достаточно высокими дипольными моментами (см. рис. 97).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение тестовой смеси. Колонки 150x3, 5мкм адсорбенты. НФ: (а) силикагель, (б) аминофаза, (в) нитрильная фаза. ПФ: гексан-изопропанол-уксусная к-та 95:2:3. 1 – примесь, 2 – примесь, 3 – примесь, 4 – бензойная кислота, 5 – метилфенилуксусная кислота, 6 – фенол. www.chromforum.ru
Рисунок 96. Разделение тестовой смеси. Колонки 150x3, 5мкм адсорбенты. НФ: (а) силикагель, (б) аминофаза, (в) нитрильная фаза. ПФ: гексан-изопропанол-уксусная к-та 95:2:3. 1 – примесь, 2 – примесь, 3 – примесь, 4 – бензойная кислота, 5 – метилфенилуксусная кислота, 6 – фенол
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение тиольного бенздиазепина от сопутствующих примесей. НФ: (а) 80x2 силикагель (5 мкм), (б) 80x2 нитрильная фаза (5 мкм). ПФ: гексан-хлороформ-изопропанол 76:20:4. 1, 2, 3, 5 – примеси, 4 – тиольный бенздиазепин. www.chromforum.ru
Рисунок 97. Разделение тиольного бенздиазепина от сопутствующих примесей. НФ: (а) 80x2 силикагель (5 мкм), (б) 80x2 нитрильная фаза (5 мкм). ПФ: гексан-хлороформ-изопропанол 76:20:4. 1, 2, 3, 5 – примеси, 4 – тиольный бенздиазепин
Впрочем, селективность для силикагеля и аминофазы также может быть различной. Эти случаи наблюдаются для основных, азотсодержащих адсорбатов. В их отношении силикагель обладает аномально высоким удерживанием, видимо, не в последнюю очередь за счет нежелательных взаимодействий с примесями металлов и активными силанольными группами. Типичный пример подобного случая приведен на рисунке 98. Следует, однако, учесть, что данное разделение проведено на силикагеле устаревшего типа, полученного осаждением кремниевой кислоты из силикатов. Тем не менее, при необходимости определять основные соединения в нормально-фазовом режиме можно рекомендовать использовать именно аминофазу.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение тестовой смеси. НФ: (а) 150x3 аминофаза (5 мкм), (б) 150x3 силикагель (5мкм). ПФ: гексан-изопропанол-триэтиламин-уксусная кислота 90:10:0.1:0.1. 1 – никотин, 2 – фенол, 3 – хинин. www.chromforum.ru
Рисунок 98. Разделение тестовой смеси. НФ: (а) 150x3 аминофаза (5 мкм), (б) 150x3 силикагель (5мкм). ПФ: гексан-изопропанол-триэтиламин-уксусная кислота 90:10:0.1:0.1. 1 – никотин, 2 – фенол, 3 – хинин
Самым эффективным инструментом воздействия на селективность НФ систем является, безусловно, изменение состава элюента. Наиболее резкого изменения селективности можно добиться, применяя в качестве полярной добавки алифатические спирты, к примеру, 2-пропанол. Спирты избирательно сольватируют соединения, содержащие в своей структуре протонные, особенно гидроксильные, функциональные группы. Таким образом, они уменьшают их удерживание гораздо сильнее, чем можно было бы ожидать, исходя из элюотропного ряда РN (см. рис. 99).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Резкое уменьшение удерживание гидроксил-содержащих соединений при увеличении доли спирта в неполярном элюенте (см. пары 1/2 и 5/6). НФ: 150x3 силикагель (5 мкм). ПФ: гексан-изопропанол-ТЭА-уксусная кислота, (а) 10%, (б) 20% и (в) 30% изопропанола в элюенте. 1 – нулевое время, 2 – фенол, 3 – никотин, 4 – фенилпропионовая кислота, 5 – бензойная кислота , 6 – хинин. www.chromforum.ru
Рисунок 99. Резкое уменьшение удерживание гидроксил-содержащих соединений при увеличении доли спирта в неполярном элюенте (см. пары 1/2 и 5/6). НФ: 150x3 силикагель (5 мкм). ПФ: гексан-изопропанол-ТЭА-уксусная кислота, (а) 10%, (б) 20% и (в) 30% изопропанола в элюенте. 1 – нулевое время, 2 – фенол, 3 – никотин, 4 – фенилпропионовая кислота, 5 – бензойная кислота , 6 – хинин
Особенно очевидной эта закономерность становится для пары фенол/бензойная кислота. Для нее селективность изменяется примерно от 2.5 на элюенте гексан-изопропанол-уксусная кислота 95:2:3 (k’ бензойной кислоты = 3.7, k’ фенола = 9.3) до 0.07 (k’ фенола = 1, k’ бензойной кислоты = 14) на элюенте гексан-изопропанол-триэтиламин-уксусная кислота 80:20:0.1:0.1. Уксусная кислота избирательно уменьшает удерживание бензойной кислоты, а изопропанол – фенола; в сумме оба эффекта и приводят к тому, что селективность пары можно изменить на два порядка.
В том случае, когда адсорбатами являются ароматические соединения, селективность системы можно сильно изменить, применяя в качестве полярной добавки хлороорганические растворители: хлористый метилен, хлороформ – которые способны к π-взаимодействиям с ароматическими адсорбатами.
В общем случае, селективность изменяется при любой замене растворителя, который применяется в качестве полярной добавки, на растворитель другого типа: спирт на эфир, простой эфир на сложный, эфир на хлорорганический растворитель и т.д. Приведенные примеры с применением спиртов и хлороорганических растворителей просто являются наиболее яркими.
Плавного изменения селективности можно добиться, применяя в качестве полярной добавки смеси двух растворителей. В этом случае селективность регулируется плавным варьированием соотношения объемных долей этих растворителей. Часто применяют следующие бинарные полярные добавки: хлористый метилен-изопропанол (λmin ≈ 235 нм), изопропанол-уксусная кислота (λmin ≈ 220-230 нм), диоксан-уксусная кислота (λmin ≈ 220-230 нм).
Третьим компонентом нормально-фазовой системы является модификатор. Модификатор образует адсорбционный слой на полярной поверхности неподвижной фазы, что приводит к стабилизации свойств адсорбента во времени, а также к улучшению эффективности и симметрии пиков кислотных и основных соединений. Доля модификатора в подвижной фазе обычно невелика: от сотых процента до нескольких процентов; в последнем случае полярный растворитель (например, уксусная кислота) может одновременно играть роль и полярной добавки, и модификатора.
В качестве модификатора чаще всего применяется уксусная кислота. Ее применение обязательно при разделении соединений кислого характера. При разделении основных соединений в качестве модификатора применяют алифатические амины, например, триэтиламин (ТЭА).
Следует помнить, что при достаточно высокой концентрации уксусной кислоты или ТЭА в элюенте (десятые доли процента и выше), реализуется режим ион-парной нормально-фазовой хроматографии. Например, при добавлении в элюент ТЭА значительно возрастает удерживание и селективность разделения кислотных соединений. Чтобы не переходить в этот режим, в качестве модификатора надо применять смесь кислоты и амина (комплексный модификатор).
Если адсорбаты представляют собой нейтральные соединения достаточно высокой полярности, то в качестве модификатора иногда применяют воду. В этом случае элюент обязательно должен содержать 5%-10% алифатического спирта, чаще изопропанола, чтобы вода растворилась в неполярной среде.
Если разделяемая смесь содержит и кислоты, и основания, то применять следует комплексный модификатор – смесь уксусной кислоты и триэтиламина. Опыт показывает, что:
- кислоты надо брать больше амина, например, в объемном отношении 3:1,
- объемная доля комплексного модификатора не должна быть большой, желательно, не более процента,
- нежелательно применять комплексный модификатор с водой, то есть использовать состав уксусная кислота-триэтиламин-вода, поскольку это может привести к выпадению органической соли в осадок и закупориванию колонки.
В системах с комплексным модификатором можно разделять достаточно полярные соединения (см. рис. 100). Существенным ограничением является очень небольшая растворимость полярных соединений в неполярном элюенте.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение ряда полярных соединений в нормально-фазовом режиме. НФ: 150x3 силикагель (5мкм). ПФ: гексан-изопропанол-ТЭА-уксусная кислота 60:40:0.2:0.75. www.chromforum.ru
Рисунок 100. Разделение ряда полярных соединений в нормально-фазовом режиме. НФ: 150x3 силикагель (5мкм). ПФ: гексан-изопропанол-ТЭА-уксусная кислота 60:40:0.2:0.75
Гидрофильная хроматография (HydrophILic Interaction Chromatography, HILIC), по сути, является нормально-фазовой хроматографией для разделения очень полярных, водорастворимых соединений: сахаров и гликозидов, органических кислот и аминокислот, полипептидов, а также различных фармацевтических препаратов (см. рис 101). От классической нормально-фазовой ВЭЖХ гидрофильная хроматография отличается, прежде всего, составом элюента. Основой элюента здесь является ацетонитрил, полярной добавкой – вода или водный буферный раствор. Вода одновременно также является модификатором, поскольку образует на полярном адсорбенте полимолекулярный адсорбционный слой. Удерживание уменьшается при увеличении доли воды.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение бисопролола фумарата и амлодипина бесилата в условиях гидрофильной хромтаографии. НФ: 250х4.6 аминофаза (3 мкм). ПФ: ацетонитрил-(вода, рН 2.5 фосфорной к-той) 90:10. 1 - фумаровая кислота, 2 - бисопролол, 3 - амлодипин, 4 - бензолсульфокислота. www.chromforum.ru
Рисунок 101. Разделение бисопролола фумарата и амлодипина бесилата в условиях гидрофильной хромтаографии. НФ: 250х4.6 аминофаза (3 мкм). ПФ: ацетонитрил-(вода, рН 2.5 фосфорной к-той) 90:10. 1 - фумаровая кислота, 2 - бисопролол, 3 - амлодипин, 4 - бензолсульфокислота
В качестве неподвижной фазы, как правило, применяют аминофазу или силикагель, реже иные полярные фазы. Среди последних можно отметить:
- цвиттер-ионные фазы на основе силикагеля с привитыми бетаинами;
- полиэтиленгликолевые фазы на основе силикагеля;
- амидные фазы (с амидной группой "вверху") как на основе силикагеля, так и на основе полиметакрилатов.
Закономерности удерживания адсорбатов в гидрофильном режиме до сих пор остаются исследованными очень плохо. Известно, по крайней мере, что удерживание увеличивается при увеличении количества полярных функциональных групп.
Наибольшее влияние на удерживание оказывают заряженные функциональные группы. Принципиальным отличием от ионной хроматографии является то, что удерживание определяется не суммарным зарядом, а именно количеством заряженных групп. Цвиттер-ионы, к примеру, не удерживаются в ионной хромтаографии, но отлично удерживаются в гидрофильной. Более того, для амфотерных соединений, содержащих так кислотные, так и основные группы, закономерности удерживания в ионном и нормально-фазовом режимах противоположны. В изоэлектрической точке (где заряд амфотерного соединения минимален) удерживание в ионной хроматографии минимально, а в гидрофильной – максимально (см. табл. 15). Таким образом, зависимости удерживания в гидрофильной хроматографии от рН могут быть сложными; наибольшее удерживание будет соответствовать такому рН, при котором количество заряженных групп адсорбата окажется максимальным.
Удерживание также возрастает при увеличении количества нейтральных полярных групп, особенно протонных: гидрокисльных, амидных и т.д. При условии равного количества полярных функциональных групп сильнее удерживаются меньшие по размеру молекулы, т.е. наличие объемных углеводородных фрагментов приводит к уменьшению удерживания.
Таблица 15. Зависимость коэффициента удерживания бетаинов от рН. Элюент: 70% ацетонитрила в 0,02М водном фосфатном буфере
В отличие от ОФ хроматографии, в гидрофильной хроматографии нет четко выраженной зависимости удерживания ни от концентрации соли в элюенте, ни от температуры (см. рис. 102).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограммы кофе в условиях гидрофильной хроматографии при температуре (а) 25°С, (б) 60°С. НФ: 150х4.6 аминофаза (3 мкм). ПФ: ацетонитрил-(вода, рН 2.5 фосфорной к-той) 90:10. 1 - кофеин; 2,3,4 - изомеры хлорогеновой кислоты. Детектирование: 270 нм (пунктирная линия), 330 нм (сплошная линия). www.chromforum.ru
Рисунок 102. Хроматограммы кофе в условиях гидрофильной хроматографии при температуре (а) 25°С, (б) 60°С. НФ: 150х4.6 аминофаза (3 мкм). ПФ: ацетонитрил-(вода, рН 2.5 фосфорной к-той) 90:10. 1 - кофеин; 2,3,4 - изомеры хлорогеновой кислоты. Детектирование: 270 нм (пунктирная линия), 330 нм (сплошная линия)
В то же время, значительное влияние на селективность разделения оказывает динамическое модифицирование солями (например, гидрофосфатом калия), кислотами (например, фосфорной кислотой, см. рис. 103) и цвиттер-ионными добавками (например, бетаином). Изменить селективность системы также можно небольшими добавками в элюент спиртов.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. (а) 5% воды 3 (б) 7.5% воды 0.5% к-ты 2. www.chromforum.ru
Рисунок 103. (а) 5% воды 3 (б) 7.5% воды 0.5% к-ты 2
При применении в гидрофильной хроматографии динамического модифицирования фосфатом необходимо помнить о существовании предельной растворимости соли в элюенте, выше которой водная солевая фаза перестает смешиваться с ацетонитрилом. Чем выше доля ацетонитрила в смеси, тем меньшей концентрации соли достаточно для ее расслоения обратно на две фазы: водносолевой раствор и ацетонитрил. Для дигидрофосфата калия зависимость критической концентрации соли от доли ацетонитрила приведена в таблице 16. На практике концентрация соли в элюенте должна быть по крайней мере в два раза ниже, чем предельная при данном соотношении ацетонитрила и воды в элюенте.
Таблица 16. Максимальное (до гетерогенизации) содержание ацетонитрила в элюенте в зависимости от концентрации дигидрофосфата калия при 20°С
Селективность в гидрофильной хроматографии также можно изменить, привнеся в механизм удерживания долю ионного режима в дополнение к основному нормально-фазовому. Для этого разделения можно проводить, к примеру, на ионных неподвижных фазах на основе силикагеля при применении элюентов, обогащенных ацтонитрилом.
При работе на силикагеле или аминофазе дополнительного вклада ионного режима дожно добиться путем динамического модифицирования ион-парными реагентами (см. рис. ..). Следует учесть, что в этом случае наличие углеводородных фрагментов у реагента никак не сказывается на его удерживании, и модифицирование лучше осуществлять заряженными полярными веществами. В кислой среде, к примеру, положительный заряд адсорбенту придаст бетаин.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограмма пчелиного яда в режиме ДИРФ. Неподвижная фаза: 80х2 Separon SGX, 5мкм. Градиентное элюирование: 50% - 80% 0.37М водного раствора дигидрофосфата калия в ацетонитриле. 1 – гиалуронидаза , 2 – апамин , 3 – адолапин , 4 – пептид 410 , 5 – фосфолипаза А2, 6 – мелиттин. www.chromforum.ru
Рисунок 104. Хроматограмма спиртового раствора экстракта из желчи наркомана. Неподвижная фаза: 120х2 Диасорб-130-Амин, 5мкм. Элюент: ацетонитрил-0.005М водный раствор тетрабутиламмоний фосфата (85:15). 1 – морфин. Разделение выполнено А.Удаловым
Вообще говоря, есть основания предполагать, что интенсивное динамическое модифицирование в гидрофильной хроматографии приводит к значительному изменению свойств адсорбента. Одним из отличительных черт хроматографической системы в этих случаях становится очень высокая емкость, что позволяет применять гидрофильную хроматографию для препаративного выделения пептидов и белков. На рисунке 105 приведена хроматограмма пчелиного яда, содержащего высокомолекулярные пептиды с молекулярной массой от 2000 до 30000. Это разделение, перенесенное в полупрепаративный вариант, способно обеспечивать загрузку 150х10 колонки на уровне 3.5 грамма на инжекцию.
В отличие от классического нормально-фазового режима, в гидрофильной хроматографии становится возможно проводить градиентное элюирование со вполне удовлетворительной воспроизводимостью времен удерживания.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограмма пчелиного яда в режиме ДИРФ. Неподвижная фаза: 80х2 Separon SGX, 5мкм. Градиентное элюирование: 50% - 80% 0.37М водного раствора дигидрофосфата калия в ацетонитриле. 1 – гиалуронидаза , 2 – апамин , 3 – адолапин , 4 – пептид 410 , 5 – фосфолипаза А2, 6 – мелиттин. www.chromforum.ru
Рисунок 105. Хроматограмма пчелиного яда в режиме ДИРФ. Неподвижная фаза: 80х2 Separon SGX, 5мкм. Градиентное элюирование: 50% - 80% 0.37М водного раствора дигидрофосфата калия в ацетонитриле. 1 – гиалуронидаза , 2 – апамин , 3 – адолапин , 4 – пептид 410 , 5 – фосфолипаза А2, 6 – мелиттин. Разделение выполнено Л. Сапрыкиным
Определение полярных веществ в гидрофильной хроматографии становится особенно выгодным, если проба содержит много липофильных компонентов матрицы образца. В гидрофильной хроматографии, в отличие от обращенно-фазовой, липофильные вещества практически не удерживаются и не мешают определению. Эту закономерность можно сознательно использовать, минимизируя затраты времени и средств на подготовку пробы, если разделение проводится в режиме гидрофильной хроматографии.
2.2.5. Ионная хроматография
Анализ ионных и ионизируемых соединений может быть выполнен при помощи ионной хроматографии (ion chromatography, IC). Адсорбент для разделения в ионном режиме содержит заряженные функциональные группы, вследствие чего его поверхность имеет определенный заряд – положительный или отрицательный. Адсорбент с положительным зарядом называется анионообменным (anion-exchange), или анионитом, а с отрицательным зарядом – катионообменным (cation-exchange), или катионитом.
Общий заряд доступной поверхности ионита определяет не только величину удерживания адсорбатов противоположного знака, но и эффективную обменную емкость адсорбента. Заряд поверхности ионита зависит как от удельного количества ионных групп, которые содержит адсорбент (полная обменная емкость, ПОЕ), так и от степени ионизации этих групп.
Иониты бывают слабыми (weak) и сильными (strong). Слабые иониты содержат слабо ионизируемые функциональные групп, и их заряд напрямую определяется значением рН водного элюента. Типичным слабым анионитом (WAX, weak anion-exchange) является аминофаза с группами -NH2. Ее положительный заряд (следовательно, величина удерживания и адсорбционная емкость) возрастают при уменьшении рН по мере ионизации аминогрупп. Типичными слабым катионитом (WCX, weak cation-exchange) является карбоксипропилированный силикагель с группами -COOH. Его отрицательный заряд возрастает при увеличении рН.
Сильные аниониты для ВЭЖХ (SAX, strong anion-exchange) содержат триметиламмонийпропильные группы -N+(CH3)3, сильные катиониты (SCX, strong cation-exchange) – сульфоновые группы R-SO3-. Заряд сильных ионитов зависит от рН значительно в меньшей степени, чем слабых. Тем не менее, эффективная емкость сильного катионита достаточно резко уменьшается начиная от рН 2-3 и ниже.
Удерживание в ионной хроматографии можно регулировать как изменением величины рН водной основы элюента, так и варьированием концентрации добавки соли в элюент.
Первый способ широко применяется в ионной хроматографии ионизирумых органических соединений. Максимальное удерживание наблюдается при таком рН, который в равной мере обеспечивает хорошую ионизацию ионных групп адсорбента и ионизацию противоположно заряженных функциональных групп адсорбатов. Так, удерживание органических оснований на сильных катионитах оказывается максимальным при рН порядка 3-4, а на слабых катионитах – около 5-6.
Для амфотерных адсорбатов, содержащих несколько кислотных и основных групп (нередко различной силы), зависимости удерживания от рН могут быть довольно сложными. В любом случае, минимальное удерживание на сильных ионитах будет наблюдаться около изоэлектрических точек (isoelectric point) амфотерных адсорбатов, т.е. в области рН, где их заряд минимален. Способ разделения в ионном режиме пептидов и других биологических полимеров по значению их изоэлектрических точек, основанный на их элюировании в градиенте рН, даже получил отдельное название – хроматофокусирование (chromatofocusing).
Второй способ – уменьшение удерживания при помощи добавки соли в элюент – применяют, как правило, в том случае, когда адсорбаты изначально являются ионами, т.е. их заряд практически не зависит от рН. Уменьшение удерживания иона-адсорбата в этом случае обусловлено явлением ионного обмена (ion exchange). Ион добавленной в элюент соли, одноименно заряженный с адсорбатом, называют вытесняющим ионом (driving ion). В конкурентной борьбе за адсорбционный центр он вытесняет с поверхности адсорбента одноименно заряженный адсорбат, что приводит к уменьшению удерживания.
В настоящее время для ионной ВЭЖХ применяют фазы как на полимерной основе, так и на основе силикагеля. Они различаются не только по своей структуре, но и по перечню выполняемых на них приложений.
Для разделения неорганических, в том числе многозарядных, ионов широко применяют мягкие, гелеобразные (слабой 6-8% сшивки) полистирол-дивинилбензольные адсорбенты, сульфированные (катиониты) или триметиламинированные (аниониты). Элюент является полностью водным; регулирование удерживания основано на ионном обмене, т.е. на регулировании концентрации в элюенте вытесняющего иона.
Обменную емкость подобных ионитов специально делают небольшой, чтобы сильно заряженные ионы могли элюироваться в достаточно мягких условиях, т.е. при небольших добавках веществ (солей, кислот или щелочей), содержащих вытесняющий ион. В свою очередь, необходимость подобных мягких условий элюирования обусловлена особенностями конструкции кондуктометрического детектора: чувствительность определения возрастает при уменьшении общей фоновой концентрации электролитов в элюенте.
Определенный недостаток подобных адсорбентов состоит в их мягкости: они выдерживают давления в средним не более 50 атм, упаковка может пострадать от гидродинамического удара (резкого перепада давления). Промывать такие колонки растворами электролитов необходимо с большой осторожностью, поскольку объем и пористость гелеобразного материала зависит от ионной силы водной среды.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение неорганических анионов ионной хроматографией с кондуктометрическим детектированием. Неподвижная фаза: IonPac AS20. Градиентное элюирование: от 5мМ до 55мМ водного гидроксида калия (вытесняющим ионом является гидроксид). 1 – фторид, 2 – ацетат, 3 – бутират, 4 – формат, 5 – хлорит, 6 – бромат, 7 – хлорид, 8 – нитрит, 9 – хлорат, 10 – бромид, 11 – нитрат, 12 – карбонат, 13 – сульфат, 14 – селенат, 15 – оксалат, 16 – фталат, 17 – фосфат, 18 – хромат, 19 – иодид, 20 – арсенат, 21 – цитрат, 22 – тиоцианат, 23 – перхлорат. www.chromforum.ru
Рисунок 107. Разделение неорганических анионов ионной хроматографией с кондуктометрическим детектированием. Неподвижная фаза: IonPac AS20. Градиентное элюирование: от 5мМ до 55мМ водного гидроксида калия (вытесняющим ионом является гидроксид). 1 – фторид, 2 – ацетат, 3 – бутират, 4 – формат, 5 – хлорит, 6 – бромат, 7 – хлорид, 8 – нитрит, 9 – хлорат, 10 – бромид, 11 – нитрат, 12 – карбонат, 13 – сульфат, 14 – селенат, 15 – оксалат, 16 – фталат, 17 – фосфат, 18 – хромат, 19 – иодид, 20 – арсенат, 21 – цитрат, 22 – тиоцианат, 23 – перхлорат. http://www.dionex.com
Для определения органических ионизируемых соединений в ионном режиме, как правило, применяют иониты на основе силикагеля, а для детектирования – УФ спектрофотометры. Обменная емкость силикагельных ионитов значительно выше, чем полимерных, что необходимо для хорошего разделения органических соединений с небольшим зарядом. В этом случае регулирование удерживания (а также часто селективности) осуществляют в основном изменением рН водной части элюента. Добавки солей применяют только в тех случаях, когда суммарный заряд органического иона приближается к единице или больше одного. Элюент, как правило, состоит из водной части и органического растворителя, например, ацетонитрила. В данном случае ацетонитрил играет роль инертного балласта, который необходим для замедления гидролиза силикагельной фазы и увеличения времени ее жизни. Кроме того, варьированием доли ацетонитрила можно плавно регулировать селективность разделения.
В последнее время для определения органических ионизируемых соединений все чаще применяют фазы, работающие в смешанном ионном/обращенно-фазовом режиме без каких-либо добавок модифицирующих ион-парных реагентов в элюент. Такие фазы производят как на основе силикагеля, так и на основе ПС-ДВБ.
Силикагельные фазы получают одновременной прививкой С18 и ионообменых фрагментов на силикагель. Полистирол-дивинилбензольные иониты для смешанного режима отличаются от полимерных ионитов для ионной хроматографии значительно большей, порядка 50%, степенью сшивки. В результате, ПС-ДВБ иониты такого типа могут работать в водноорганических средах без набухания, т.е. они совместимы с добавками ацетонитрила (или иного органического растворителя) в элюент.
Для обоих материалов соотношение обращенно-фазового и ионного режимов регулируется долей ацетонитрила в элюенте. При увеличении доли ацетонитрила удерживание в обращенно-фазовом режиме подавляется, в то время как удерживание в ионном режиме всегда остается примерно одинаковым, т.е. оно не сильно зависит от состава водноорганической смеси.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение тестовой смеси в «ионообменно-обращенно-фазовом» режиме. Неподвижная фаза: 150х4.6 Primesep 100. Элюент: (вверху) вода-ацетонитрил-трифторуксусная кислота 70:30:0.2 – больший вклад обращено-фазового режима, (внизу) вода-ацетонитрил-трифторуксусная кислота 30:70:0.15 – больший вклад катионообменного режима. 1 – миндальная к-та, 2 – тирозин, 3 – бензойная к-та, 4 – пиридин, 5 – фенилаланин, 6 – бензиламин, 7 – бензонитрил, 8 – толуол. www.chromforum.ru
Рисунок 109. Разделение тестовой смеси в «ионообменно-обращенно-фазовом» режиме. Неподвижная фаза: 150х4.6 Primesep 100. Элюент: (вверху) вода-ацетонитрил-трифторуксусная кислота 70:30:0.2 – больший вклад обращено-фазового режима, (внизу) вода-ацетонитрил-трифторуксусная кислота 30:70:0.15 – больший вклад катионообменного режима. 1 – миндальная к-та, 2 – тирозин, 3 – бензойная к-та, 4 – пиридин, 5 – фенилаланин, 6 – бензиламин, 7 – бензонитрил, 8 – толуол. http://www.primesep.com
Селективность разделения любых, органических и неорганических, ионов можно в определенных пределах изменять, изменяя степень их гидратации. В этом случае увеличение доли органического растворителя в элюенте и повышение температуры действуют в одном направлении, приводя к уменьшению гидратации. По большому счету, оба этих фактора могут воздействовать на удерживание разнонаправленно; в результате, удерживание остается примерно на одном уровне, а селективность разделения изменяется.
2.2.6. Хроматография с переносом заряда
В хроматографии с переносом заряда, ВЭЖХ ПЗ (CT HPLC, charge-transfer HPLC) происходит удерживание и разделение ненасыщенных (в том числе ароматических) органических соединений на неподвижных фазах, содержащих в своей структуре:
- π-донорные/акцепторные фрагменты,
- координационно ненасыщенные ионы (атомы) переходных металлов с d-электронными оболочками.
Удерживание объясняется образованием адсорбционных комплексов с переносом заряда π-π и π-d типов, т.е. за счет π-взаимодействий.
Наиболее ярко π-взаимодействия проявляются в неполярных средах, в которых из-за отсутствия сольватации адсорбционные π-π и π-d комплексы наиболее устойчивы (π-взаимодействие требует непосредственного контакта адсорбата и адсорбционного центра). По этой причине подвижные фазы в хроматографии с переносом заряда, как правило, состоят из алифатического углеводорода, например, гексана (основы), и смешивающегося с ним более полярного органического растворителя (добавки).
Наибольшей элюирующей силой в ПЗ режиме обладают растворители, одновременно способные к π-взаимодействиям и обладающие значительным дипольным моментом. Вид элюотропного ряда растворителей для ПЗ режима в общем случае зависит от структуры адсорбата.
Для слабополярных адсорбатов, не обладающих дипольным моментом, элюирующая сила растворителя целиком определяется его способностью к π-взаимодействиям. Она увеличивается в ряду гексан < изопропанол << ТГФ < этилацетат < толуол < хлористый метилен (см.рис 75). Наименьшей элюирующей силой обладают алифатические углеводороды, спирты; влага также не оказывает заметного влияния на удерживание. Максимальной элюирующей силой обладают хлороорганические и ароматические растворители, а также кетоны (ацетон).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Элюотропный ряд, составленный согласно экспериментальным значениям lg k’ (верхние столбцы) и k’ (нижние столбцы) нафталина при элюировании на сверхсшитом полистироле. Для гексана принято значение 0, для дихлорметана – 100. www.chromforum.ru
- 112_1.jpg (22.56 Кб) Просмотров: 23990
Рисунок 111. Элюотропный ряд, составленный согласно экспериментальным значениям lg k’ (верхние столбцы) и k’ (нижние столбцы) нафталина при элюировании на сверхсшитом полистироле. Для гексана принято значение 0, для дихлорметана – 100
В режиме с перенсом заряда удерживание в общем случае зависит от сочетания энергетики и геометрии высших занятых и низших свободных молекулярных орбиталей, ВЗМО и НСМО (HOMO, LUMO), взаимодействующих систем – то есть адсорбата и адсорбента.
Упрощая, в ситуации с π-π взаимодействием можно сказать, что для ароматических соединений удерживание в ПЗ режиме возрастает при увеличении количества π-электронов в сопряженной системе. Удерживание также усиливается введением в ароматическую структуру электрон-донорных и электрон-акцепторных заместителей, обладающих сильным мезомерным эффектом: карбонильной группы, нитро-группы, амино-группы и т.д. Гетероароматические соединения (с неподеленной электронной парой гетероатома, которая встраивается в сопряженную систему) обладают большим удерживанием, чем их полностью «углеродные» аналоги, имеющие вместо гетероатома два углерода с двумя π-электронами.
Хорошей иллюстрацией этих закономерностей является диаграмма на рисунке 112, показывающая некоторую обобщенную характеристику способности ряда ароматических соединений к удерживанию в режиме ПЗ (величина для анизола принята за ноль, для нитробензола – за единицу). Типичное разделение простых ароматических соединений в режиме ПЗ приведено на рисунке 112.
Рисунок 112. Обобщенная характеристика способности ряда ароматических соединений к удерживанию в режиме ПЗ. Величина для анизола принята за ноль, для нитробензола – за единицу. Характеристика получена в результате обработки методом главных компонент данных по удерживанию адсорбатов на фазах Chromalite-5HGN (сверхсшитом полистироле), Chiralcel-OD и Pirkle Whelk-O,1 (см. Приложение Б) при использовании элюентов на основе гексана
Рисунок 113. Типичное разделение простых ароматических соединений в режиме переноса заряда. Неподвижная фаза: 250x4.6 Chromalite 5-HGN (сверхсшитый полистирол). Градиентное элюирование. Подвижная фаза А: гексан-хлористый метилен 95:5, подвижная фаза В: гексан-хлористый метилен 60:40; 100% А в течение 1 мин., затем 0-100% В за 15 мин. 1 – бензол, 2 – стирол, 3 – анизол, 4 – нафталин, 5 – изотиоцианат, 6 – нитробензол, 7 – фенантрен
В режиме ПЗ с реализацией π-π взаимодействий работают фазы:
- на основе силикагеля с привитыми конденсированными ароматическими соединениями, например, пиреном (пиренил-фаза, PYE);
- углеродные фазы для жидкостной хроматографии типа Hypercarb;
- сверхсшитые полистирольные фазы.
Эти фазы обепечивают также проведение хроматографирования в смешанном с переносом заряда/обращенно-фазовом режиме. Вклад обращенно-фазового режима возрастает при переходе от элюентов на основе гексана к элюентам на основе водноорганических смесей (см. рис.).
Рисунок 114. Хроматограмма модельной смеси в различный режимах элюирования. Неподвижная фаза: 250x4.6 Chromalite 5-HGN (сверхсшитый полистирол). Обращенно-фазовый режим (а), элюент: ацетонитрил-изопропанол-вода 80:15:5; «смешанный» режим (б), элюент: хлористый метилен-метанол 1:1; режим с переносом заряда (в), элюент: гексан-хлористый метилен 80:20. 1 – бензальдегид, 2 – анизол, 3 – кумол, 4 – бромбензол, 5 – нафталин, 6 – антрахинон, 7 – индол. При переходе из ОФ режима в смешанный исчезает инкремент алкильных групп в удерживание (кумол перемещается с третьего места на первое). Уже при переходе от смешанного режима к режиму ПЗ происходит резкое увеличение удерживания сопряженных карбонил-содержащих ароматических соединений (обращение порядка элюирования для пары антрацен/антрахинон, также бензальдегид перемещается со второго на пятое место)
Наиболее известным приложением, в котором используют ПЗ режим с реализацией π-d взаимодействия, является разделение триглицеридов (или иных эфиров) жирных кислот на силикагеле, динамически модифицированном нитратом серебра. Разделение идет согласно числу двойных связей с молекуле: чем больше ненасыщенных связей, тем сильнее удерживание. Подобным же образом можно проводить разделение смесей углеводородов на группы: алканов, моно-, би- и т.д. ароматических углеводородов и, наконец, олефинов (содержащих ненасыщенные кратные связи), удерживание которых будет максимальным. Для таких разделений также применяют элюенты на основе гексана; элюотропный ряд растворителей для π-π взаимодействий в целом пригоден в для ПЗ режима с реализацией π-d взаимодействий.
Таким образом, фазы с ароматическими фрагментами в структуре хорошо удерживают и разделяют ароматические и карбонилсодержащие соединения, тогда как фазы с закрепленными ионами или комплексами переходных металлов, к примеру, серебра, чрезвычайно селективны по отношению к соединениям с кратными связями углерод-углерод.
К режиму ПЗ, в принципе, можно отнести все ситуации с удерживаем за счет n-d взаимодействий, то есть, фактически, за счет хелатирования. Адсорбатами могут быть, к примеру, ионы переходных металлов; в этом случае адсорбент должен содержать привитый хелатирующий лиганд с неподеленными электронными парами. Или же, напротив, адсорбатами могут быть хелатирующие соединения – тогда адсобент должен содержать ион или атом металла (например, серебра, свинца, меди и т.д.), закрепленный, к примеру, на силикагельном ионите. Вид хроматографии с доминированием ПЗ режима с реализацией n-d взаимодействий называют лигандообменной хроматографией. Дополнительными режимами в лигандообменной хроматографии, как правило, являются ионный и эксклюзионный.
2.2.7. Эксклюзионная хроматография. Ионная эксклюзия
Эксклюзионная хроматография является рутинной техникой определения молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, а также применяется для разделения смесей различных олигомерных и полимерных соединений.
Эксклюзионная хроматография основана на исключении молекул определенного эффективного диаметра из пор с меньшим диаметром. В результате крупные молекулы проходят меньший путь внутри пор, и элюируются раньше мелких. Неподвижной фазой в этом случае является неподвижный элюент внутри пор, а подвижной – элюент, движущийся между частицами носителя. Никакого взаимодействия между твердым носителем и разделяемыми веществами не происходит.
Объем хроматографической колонки, не занятый материалом адсорбента, то есть нулевой объем, можно представить как сумму объема каналов между частицами адсорбента (межгранульный объем VМГ) и объема пор VП адсорбента: V0 = VМГ + VП.
В адсорбционной хроматографии нулевой объем является минимальным, т.е. объемом удерживания полностью неудерживаемого соединения; максимальный удерживаемый объем, в принципе, ничем не ограничен. В эксклюзионной хроматографии, напротив, нулевой объем как раз является максимальным удерживаемым объемом, а минимальным удерживаемым объемом является межгранульный объем колонки. Поэтому термин "нулевой объем", вполне приемлемый для адсорбционных режимов, не является удачным для эксклюзионного режима. Вместо "нулевого объема" далее в этой главе будем пользоваться термином мертвый объем колонки VМ. Таким образом, приведенное выше равенство примет вид VМ = VМГ + VП.
Термин "удерживание" для эксклюзионного режима также не применяют. Это обусловлено не какими-либо принципиальными соображениями, а простым желанием избежать путаницы – все-таки природа адсорбции и эксклюзии различна. Вместо "удерживается сильнее" поэтому говорят "эксклюдируется слабее", а вместо "удерживается слабее" – "эксклюдируется сильнее".
Таким образом, эксклюзионная хроматограмма начинается в момент достижения межгранульного объема колонки, в котором элюируются самые большие молекулы, и заканчивается при достижении мертвого объема колонки, в котором элюируются самые маленькие молекулы (см. рис. 115). Если адсорбционные взаимодействия с материалом адсорбента полностью подавлены (например, выбором элюента с крайне высокой элюирующей силой), то после мертвого времени никаких соединений элюироваться с хроматографической колонки не должно.
Параметром, отражающим эффективный размер молекулы соединения, в эксклюзионной хроматографии принято считать логарифм его молекулярной массы. Таким образом, с этого момента мы будем говорить не о "больших молекулах", а о "соединениях с большой молекулярной массой".
Зависимость между объемами эксклюзии и логарифмом молекулярных масс соединений (для данной эксклюзионной колонки и данного типа разделяемых соединений) называется градуировочной кривой. Ее не надо путать с градуировочной кривой для количественного анализа. Именно при помощи градуировочной кривой проводится расчет молекулярных масс соединений по их объемам эксклюзии, полученным из хроматограммы (см. рис. 115).
Рисунок 115. Хроматограмма в эксклюзионном режиме (а) и градуировочная кривая (б)
Разделение в эксклюзионном режиме может произойти только в том случае, если размер пор носителя (адсорбента) соответствует размеру разделяемых молекул. В чем-то по смыслу это напоминает явление дифракции, которое наблюдается только при соответствии длины волны размеру препятствий на пути ее распространения.
Количественной характеристикой способности колонки к эксклюзионным разделениям соединений с различными молекулярными массами является доля объема, которая приходится на единицу разницы логарифмов молекулярных масс разделенных соединений. Эта характеристика называется разделительной емкостью; она численно равна тангенсу угла наклона калибровочной кривой в выбранной точке. Другими словами, чем горизонтальнее линейный участок калибровочной кривой, тем лучше разделяются соединения с соответствующими этому участку молекулярными массами. Разделительная емкость является аналогом селективности в адсорбционной хроматографии.
Верхним пределом эксклюзии (часто его называют просто пределом эксклюзии) называют максимальную молекулярную массу соединений, молекулы которых еще могут проникать в поры данного адсорбента, т.е. не эксклюдироваться им. Нижним пределом эксклюзии будем называть молекулярную массу, ниже которой молекулы проникают во все доступные поры носителя.
Диапазоном линейности называют диапазон молекулярных масс, в границах которого калибровочная кривая линейна. Как правило, эксклюзионную неподвижную фазу применяют именно для разделений соединений с молекулярной массой внутри диапазона линейности, поскольку в этом случае точность результатов определения молекулярной массы или ММР оказывается наилучшей.
Рисунок 116. Соответствие распределения пор по объему градуировочной кривой эксклюзионной фазы
Высокого диапазона линейности эксклюзионных упаковок можно достичь, по крайней мере, двумя путями. Первый путь заключается в последовательном соединении нескольких колонок, заполненных адсорбентами с различными средними диаметрами пор. Он хорош тем, что вместе с диапазоном линейности позволяет увеличить общий объем пор. Минус заключается в том, что он чисто технически не очень удобен (требует использования больших объемов растворителей, производительных насосов), а также дорог, поскольку необходимо приобретать несколько колонок.
Можно решить задачу другим путем: скомбинировать несколько разных адсорбентов таким образом, чтобы эксклюзионная упаковка имела поры всех возможных размеров, причем примерно в равных объемах (см. рис. 116). Как правило, современные эксклюзионные колонки с широким диапазоном линейности получают этим методом. Поскольку их разделительная емкость значительно ограничена высоким диапазоном линейности, разделение на современных колонках стараются увеличить за счет улучшения качества упаковки адсорбента, то есть их эффективности.
Таким образом, хороший эксклюзионный адсорбент должен иметь высокую пористость и необходимый размер пор (см. рис 116). Под конкретную же задачу эксклюзионную колонку следует подбирать таким образом, чтобы обеспечить оптимальное соотношение между ее диапазоном линейности и разделительной емкостью (см. рис. 117). Например, для рутинных определений соединений с приблизительно известным ММР чаще применяют эксклюзионные фазы с высокой разделительной емкостью (см. рис. 117, пунктирная линия), а для исследовательских задач – с высоким диапазоном линейности (см. рис. 117, непрерывная линия).
Рисунок 117. Градуировочные кривые для различных эксклюзионных колонок. А: подходящая (непрерывная линия) и неподходящая (пунктирная линия) для эксклюзионных разделений колонки. Б: эксклюзионная колонка с высокой разделительной емкостью (пунктирная линия) и с высоким диапазоном линейности (непрерывная линия)
Интересные приложения можно выполнять на эксклюзионных упаковках с микропористыми частицами – где микропорами являются, например, структурные ячейки сшитого полимера. Их средний диаметр составляет 20-30 ангстрем, то есть он сопоставим с размером больших молекул. Таким образом, эксклюзионная хроматография на микропористых неподвижных фазах может применяться для разделения не только полимерных, но и крупных мономерных молекул по размеру (см. рисунки 118 и 119).
Рисунок 118. Эксклюзионное разделение олигомеров полистирола на неподвижной фазе 250x4.6 Chromalite 5-HGN. Подвижная фаза: хлористый метилен. 1 – стирол, 2 – димер стирола, 3 – 980 Да, 4 – 10100 Да, 5 – 330000 Да
Рисунок 119. Экслюзионное разделение компонентов растительного масла: (а) свежее масло, (б) стоявшее на свету в течение 2 месяцев. Неподвижная фаза: 250x4.6 Chromalite 5-HGN. Подвижная фаза: хлористый метилен
По полярности применяемых подвижных фаз эксклюзионные методы можно разделить на водные, гель-фильтрационные, ГФХ (gel-filtration) и неводные, гель-проникающие, ГПХ (gel-permeation, GPC). Они несколько различаются по методическим подходам, но ничем не отличаются друг от друга по сути.
Гель-проникающий вариант эксклюзионной хроматографии применяют, как правило, для анализа различных синтетических полимеров. В качестве подвижных фаз применяются органические растворители: ТГФ (тетрагидрофуран), хлороформ, толуол, ГФИП (гексафторизопропанол), ДМСО (диметилсульфоксид). С одной стороны, они должны обеспечивать необходимую растворимость полимерного образца; с другой стороны, они должны полностью подавлять любые адсорбционные механизмы удерживания. Иногда для дополнительного подавления адсорбционных режимов хромтаографирование проводят при повышенной температуре.
В качестве неподвижных фаз применяют как сшитые полимерные материалы, так и силикагели различной пористости. При применении ПС-ДВБ эксклюзионных фаз необходимо подавлять режимы обращенно-фазовый и с переносом заряда, при применении силикагелей – нормально-фазовый. Соответственно, выбор нейтральных неполярных полистирол-дивинилбензольные эксклюзионных фаз оправдан в тех случаях, когда разделяемые полимеры обладают значительной полярностью. Для эксклюзионного разделения неполярных полимеров вполне пригодны силикагели.
Гель-фильтрационный вариант, как правило, применяют для анализа натуральных полимеров: водорастворимых олигосахаридов, белков, нуклеиновых кислот. Подвижной фазой в этом случае служит водный буферный раствор, иногда с небольшой добавкой органического растворителя. В качестве неподвижных фаз применяют пористые гидрофильные полимерные материалы (например, гидроксиметакрилаты), а также силикагели, химически модифицированные гидрофильными соединениями (например, глицериновые или диольные фазы).
Для градуировки эксклюзионных фаз часто применяют стандартные образцы полистиролов и полиэтиленгликолей для ГПХ и стандартные образцы декстринов – для ГФХ. Если градуировка проводится не по тому соединению, которое определяется, то в калибровочную кривую необходимо ввести поправку, вычисляемую из значения характеристической вязкости анализируемого полимера. Знание характеристической вязкости пробы позволяет построить так называемую универсальную калибровочную кривую, которая позволяет определять из хроматографических данных ММР полимеров, стандарты для которых отсутствуют.
Есть и более простой способ решить проблему отсутствия стандартов. Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС) является методом, позволяющим определять ММР полимерных молекул. Сам спектрометр слишком дорог, и его нецелесообразно применять для рутинных измерений; однако, задача градуировки эксклюзионной колонки для него вполне адекватна. Проведя совместный анализ реперных образцов методом МАЛДИ и эксклюзионной хроматографей, можно отградуировать применяемую колонку, и в дальнейшем применять как метод для рутинных определений именно эксклюзионную хроматографию.
Отдельным эклюзионным режимом, в принципе, можно считать ионную эксклюзию – исключение из пор имеющего заряд адсорбента (например, ионита) одноименно заряженных ионов. Принцип разделения в этом случае также основан на эксклюзии, но не по величине молекулы, а по заряду молекулярного иона. Таким образом, если на катионит нанести смесь катионов и анионов, то катионы будут разделяться за счет различного удерживания в ионном адсорбционном режиме, а анионы будут разделяться в режиме ионной эксклюзии.
Количество самостоятельных приложений с применением ионной эксклюзии невелико. Наиболее распространенным является разделение органических фруктовых кислот на ПС-ДВБ катионите в водородной форме. Однако, даже в этом случае наблюдается не чистый ион-эксклюзионный, а смешанный эксклюзионный/ион-эксклюзионный режим.
