Глава 1.6. ТФЭ - твердофазная экстракстракция

[Константин Сычев]

1.6. Адсорбционные методы подготовки пробы: адсорбционная очистка (АО) и твердофазная экстракция (ТФЭ)

1.6.1. Основы методов ТФЭ и АО

Метод твердофазной экстракции, ТФЭ, основан на извлечении целевых соединений из жидких образцов, экстрактов и газообразных образцов путем их адсорбции на малых количествах (от милиграмм до сотен миллиграмм) адсорбционных материалов.
Элюирование (смыв) целевых соединений осуществляют сравнительно небольшими объемами в пределах десяти миллилитров, что дает возможность избежать при проведении пробоподготовки всех неудобств, связанных с применением больших объемов растворителей.
Метод адсорбционной очистки, АО, основан на извлечении из жидких образцов и экстрактов загрязняющих их компонентов матрицы путем адсорбции на малых количествах (от миллиграмм до сотен миллиграмм) адсорбционных материалов. При проведении АО целевые соединения проскакивают через адсорбционный материал, то есть не адсорбируются, а остаются в образце (экстракте).
Закономерности и технические средства проведения ТФЭ и АО одинаковы; различие подходов заключается в логике их применения. В методе ТФЭ целевые соединения на первой стадии удаляются из образца (экстракта) адсорбцией на подходящем материале, что позволяет проводить как очистку пробы, так и ее концентрирование, а также проводить замену растворителя пробы. В методе АО целевые соединения проскакивают через адсорбент, который лишь поглощает часть загрязняющих пробу соединений; таким образом, АО применима исключительно для проведения очистки пробы.
Нередко АО осуществляют на достаточно дешевых адсорбентах, которые применяют однократно и выбрасывают после использования. При проведении ТФЭ, напротив, стараются регенерировать адсорбционные материалы и использовать их многократно – что дает возможность применять для твердофазной экстракции более дорогие и качественные (нередко также специализированные) адсорбенты.
В совокупности ТФЭ и АО называют адсорбционными методами подготовки пробы. Адсорбция может осуществляться в статических и динамических условиях.
В статическом методе адсорбционный материал (в виде сыпучего адсорбента, спрессованной таблетки или полимерной пленки) выдерживают в жидком образце (экстракте). В случае статической АО очищенный экстракт с целевыми соединениями декантируют, а использованный адсорбционный материал отбрасывают.
Как правило, в статических условиях проводят именно адсорбционную очистку (АО), а не ТФЭ. Это обусловлено тем, что время достижения адсорбционного равновесия может быть весьма большим – порядка десятков минут или даже часов, даже при условии значительного удерживания целевых соединений выбранным адсорбентом. Кроме того, степень извлечения в этом случае сильно зависит от матрицы образца (экстракта). Все это неприемлемо для ТФЭ, но вполне приемлемо для АО, если задача состоит лишь в удалении большей части загрязняющих компонентов при минимуме затрат труда.
ТФЭ, как правило, проводят в динамическом варианте: жидкий образец (экстракт) пропускают через картридж, заполненный адсорбентом. Подобным образом в динамическом режиме проводят и адсорбционную очистку.
Разница, как правило, заключается в том, что при проведении АО в качестве картрижа применяют небольшую стеклянную колонку, заполненную адсорбентом объемом не более нескольких миллилитров. Для проведения ТФЭ спользуют специальные адсорбционные картриджи объмом не более 1 мл, а в случае твердофазной экстракции значительных объемов – экстракционные диски с пористой полимерной пленкой.
Жидкий образец может нагнетаться в картридж с помощью воздушного компрессора, вакуумного насоса, перистальтического насоса, а также вручную. Для проведения одновременной ТФЭ большого количества образцов при нагнетании вакуумным насосом или воздушным компрессором применяют специальную емкость-держатель для установки адсорбционных картриджей – манифолд.
Активно развивается сравнительно новый технический способ реализации динамической адсорбции – микро ТФЭ (МТФЭ), или MEPS (Micro Extraction by Packed Sorbent). Микрокартридж с объемом адсорбента порядка нескольких микролитров расположен в основании сменной иглы специального аналитического шприца на 100-250 мкл; пробу пропускают через картридж вручную, при помощи автосамплера или специального автоматизированного устройства (e-Vol).
На данный момент MEPS является простым удобным методом адсорбционной очистки микроколичеств пробы, которую можно непосредственно (он-лайн) вводить из MEPS шприца в хроматограф. Применение данного метода для ТФЭ пока несколько ограничено отсутствием коммерчески доступных MEPS картриджей с современными полимерными адсорбционными материалами.

1.6.2. Последовательность процедуры ТФЭ

Процедура ТФЭ состоит из достаточно стандартной последовательности из нескольких этапов: 1) кондиционирования адсорбента, 2) нанесения пробы, 3) промывки адсорбента, 4) сушки адсорбента, 5) смыва (элюирования) целевых соединений, 6) регенерирования адсорбента. Если картридж используется многократно, то данная последовательность повторяется по циклу.
Далеко не всегда бывает необходимо задействовать все шесть стадий; нередко в зависимости от конкретной ситуации можно опускать шаги 3, 4 и 6, то есть не всегда адсорбент промывают, сушат и подвергают отдельной регенерации. Таким образом, основных стадий ТФЭ все-таки три: конционирование адсорбента, нанесение пробы и смыв целевых соединений.
Кондиционирование адсорбента проводят чистым растворителем, близким по свойствам растворителю пробы. Так, если проба является водной, то картридж кондиционируют водой. В случае ТФЭ из гексанового экстракта адсорбент кондиционируют гексаном.
При использовании неполярных С18 адсорбентов на основе силикагеля при проведении ТФЭ из водных образцов перед кондиционированием водой проводят т.н. «активацию» адсорбента небольшим объемом органического растворителя: ацетонитрилом или спиртом. Это замечание относится только к алкил-привитым силикагелям, то есть «активировать» современные полимерные адсорбенты перед проведением ТФЭ не требуется.
Объем растворителя для кондиционирования приблизительно равен 2-5 объемам адсорбционного картриджа.
После кондиционирования наносят пробу, то есть пропускают жидкую пробу через картридж. Важным параметром является скорость нанесения пробы; по возможности она не должна превышать 5 объемов картриджа в минуту для классического варианта ТФЭ на адсорбционном картридже. При ТФЭ на адсорбционном диске и МТФЭ, как правило, допустимы более высокие скорости.
Главное, чтобы при нанесении пробы целевые соединения не проскочили, чтобы они количественно поглотились адсорбентом.
Уже на стадии нанесения пробы происходит ее начальная очистка, поскольку только часть загрязняющих компонентов остается на адсорбенте вместе с целевыми соединениями – другая часть плохо удерживаемых компонентов матрицы проскакивает через картридж. Чтобы усилить эффект предварительной очистки, проводят промывку картриджа. Как правило, промывают тем же растворителем, который применяется для кондиционирования, то есть при ТФЭ из водных образцов картридж промывают водой. Главное при промывке – не перестараться и не начать смывать целевые соединения. По этой причине объем промывки, как правило, не превышает двух объемов картриджа.
После промывки (или после нанесения пробы, если промывка не проводилась) жидкость из картриджа необходимо удалить. Это не сушка, которая далеко не всегда нужна. Просто перед смывом целевых соединений большую часть промывочной жидкости или оставшегося образца необходимо вытеснить воздухом (как вариант – азотом). Не будет ничего хорошего, если промывочная жидкость смешается с элюирующим растворителем. Адсорбент после этой процедуры остается влажным.
Далее можно проводить, собственно, сушку картриджа. Если одной из целей ТФЭ является замена растворителя пробы, то сушка однозначно нужна.
Также сушку можно проводить в том случае, когда элюирующий растворитель не смешивается с остаточной промывочной жидкостью («влажность» адсорбента), вытесняя ее в виде капли; в результате подобной непроизвольной жидкостной экстракции часть целевых соединений может потеряться, оставшись в капле промывочной жидкости.
Сушка неприемлема, если целевые соединения летучи. Если целевые соединения подвержены окислению, сушить картридж необходимо не воздухом, а азотом.
Неудобство сушки связано в основном с тем, что это достаточно долгая процедура – для полной просушки большого картриджа с 1 мл адсорбента может потребоваться 15-20 минут.
Элюирование стараются проводить как можно меньшим объемом подходящего растворителя, который, тем не менее, должен быть достаточен для смыва целевых соединений с адсорбционного картриджа. Разумный диапазон для объема элюирующего растворителя составляет 1-10 объемов картриджа. Степень концентрирования при ТФЭ определяется отношением объема нанесенной пробы к объему смыва (элюата). Кроме того, элюат можно дополнительно сконцентрировать отгонкой растворителя в токе азота, если целевые вещества нелетучи и элюат не слишком насыщен компонентами матрицы (см. гл. «Концентрирование пробы отгонкой растворителя»).
Растворитель для элюирования должен по возможности удовлетворять целому ряду критериев, поэтому к его выбору надо подходить ответственно. Главное – он должен опеспечивать количественное элюирование целевых соединений. Далее, если планируется дополнительно упаривать элюат в токе азота, то требуемый растворитель должен быть как можно более летучим (например, диэтиловый эфир, ацетон, дихлорметан). Если элюат напрямую вводят в газовый хроматограф, растворитель также должен быть досточно летучим. Подобным образом, если элюат напрямую или после разбавления вводят в жидкостной хроматограф, растворитель для смыва должен быть растворим в подвижной фазе или являться одним из ее компонентов.
Как уже было отмечено, на стадии смыва целевых соединений происходит фактическая замена растворителя пробы. Более того, на этой стадии также происходит дополнительная очистка пробы, поскольку часть компонентов матрицы остается на адсорбенте даже после элюирования целевых соединений.
Наконец, если финальный объем элюата меньше объема наносимой пробы, то после стадии смыва можно точно определить степень концентрирования пробы. В том случае, когда основной целью проведения ТФЭ является именно концентрирование, она может достигать 1000 и даже более.
Специальную регенерацию картриджа проводят в том случае, когда после смыва целевых соединений адсорбент остается очевидно загрязненным компонентами матрицы образца. Достаточно популярным растворителем для регенерации является ацетон, обладающий большой элюирующией силой по всех адсорбционных режимах и неограниченно смешиваюий со всеми органическими растворителями и водой.
После регенерации проводят кондиционирование картриджа, и процесс экстракции поворяется.
В отличие от ТФЭ, для процесса адсорбционной очистки можно выделить только два основных этапа: нанесение пробы и промывку адсорбента. Элюаты, собранные на этих стадиях, объединяют; целевые соединения должны количественно присутствовать в объединенном элюате. Кондиционирование и регенерацию адсорбента при АО проводят редко, поскольку в большинстве случаев адсорбент используют однократно.


1.6.3. Он-лайн ТФЭ для ВЭЖХ

Описанную выше процедуру ТФЭ можно реализовать в двух вариантах: офф-лайн и он-лайн. В офф-лайн варианте (вне линии) проба готовится отдельно, а затем вводится в хроматограф. Это наиболее простой и привычный вариант, и поэтому его применяют в большинстве случаев.
В он-лайн (в линии) варианте ТФЭ картридж включается в систему инжектирования хроматографа. Он-лайн ТФЭ из жидких образцов, как правило, совмещают с жидкостным хроматографом, а он-лайн ТФЭ из газообразных образцов (см. гл. «Статическая и динамическая парофазная экстракция») – с газовым хроматографом.
Если для газовой хроматографии он-лайн ТФЭ из воздуха или паровой фазы – это стандартная техника, то в жидкостной хроматографии это техника нередко эксклюзивная и требующая хорошей профессиональной подготовки аналитика. Тем не менее, он-лайн ТФЭ для ВЭЖХ имеет весьма большой потенциал и стоит того, чтобы отдельно рассмотреть варианты применения этой техники.
В он-лайн ВЭЖХ картридж с адсорбентом, по сути, ничем не отличается от привычной картриджной предколонки в держателе. Само применение предколонки, фактически, является он-лайн вариантом проведения адсорбционной очистки. В ТФЭ, однако, вначале целевые соединения на «предколонке» необходимо удержать, и лишь затем элюировать в аналитическую колонку.
В наиболее простой схеме он-лайн ВЭЖХ адсорбционный картридж для ТФЭ устанавливают на инжектор вместо петли. В этом случае все процедуры но нанесению пробы и промывке картриджа приходится проводить вручную, при помощи аналитического шприца через входной порт инжектора. Однако, во-первых, это неудобно и к тому же почти сводит на нет саму идею он-лайн подготовки пробы. Во-вторых, вручную можно продавить лишь картридж, заполненный крупнозернистым адсорбентом – а для он-лайн ВЭЖХ как раз стараются применять высокоэффективные картриджи с мелкозернистыми адсорбентами.
Значительно лучший вариант реализации он-лайн ТФЭ в ВЭЖХ предполагает наличие еще одного шестиходового крана (в дополнение к инжектору) и еще одного изократического насоса. Дополнительный насос необходим для нанесения пробы на ТФЭ картридж и его промывки. Для этой цели необязательно применять «классический» насос высокого давления с пределом в 400 атм; вполне достаточно использовать более дешевые дозирующие насосы с пределом давления порядка 20 атм.
На инжектор устанавливают большую петлю объема 1-2 мл для дозирования образца. Образец вводят традиционно в петлю инжектора, однако, используя шприц большего объема. В качестве насоса к инжектору подключают вспомогательный насос, прокачивающий промывочный растворитель. На выходе инжектора монтируют второй шестиходовой кран; к нему вместо петли монтируют ТФЭ картридж, подключают аналитическую насосную систему хроматографа и на выходе устанавливают аналитическую колонку. При запуске анализа проба переносится из петли в ТФЭ картридж, который затем промывается. При переключении второго крана в ТФЭ картридж попадает элюент, и с потоком элюента целевые вещества переносятся в аналитическую колонку.
Если в такой схеме вместо ТФЭ картриджа установить ВЭЖХ колонку, то мы получим систему двумерной жидкостной хроматографии (см. гл. «Двумерная ВЭЖХ»). Таким образом, он-лайн ТФЭ является частным случаем двумерной хроматографии, где первая колонка имеет меньшую эффективность и применяется для предварительного фракционирования образца.
Разберем преимущества и недостатки он-лайн ТФЭ в ВЭЖХ, сравнив эту технику с офф-лайн ТФЭ.
Наиболее очевидным преимуществом он-лайн ТФЭ является низкая вероятность потери целевых веществ при смыве (остается, однако, возможность потери при нанесении пробы). Крайне низка и вероятность перекрестного загрязнения проб. То есть, в принципе, он-лайн ТФЭ надежнее офф-лайн варианта.
Второе преимущество он-лайн ТФЭ – неизбежная автоматизация процедуры твердофазной экстракции. Хотя, скорее, это не столько даже преимущество, сколько неотъемлемое свойство данной техники. Автоматизировать при необходимости можно и офф-лайн ТФЭ, но он-лайн ТФЭ автоматизорована по определению – в этом вся суть подхода.
Производительность и ресурсоемкость двух вариантов ТФЭ сравнивать некорректно, поскольку все сильно зависит от специфики каждой конкретной методики.
К основному недостатку он-лайн ТФЭ следует отнести многочисленные ограничения, накладываемые на процедуру ТФЭ типом аналитической системы. Различные ее компоненты: применяемый хроматографический режим, используемая аналитическая колонка, система инжектирования и даже детектор – предъявляют к процедуре он-лайн ТФЭ определенные требования, что значительно сокращает гибкость метода ТФЭ.
Например, в обращенно-фазовом адсорбционном режиме условие «комфортной» совместимости он-лайн ТФЭ и аналитической колонки формулируют таким образом: гидрофобность адсорбционного материала обращенно-фазовой колонки должна по возможности не уступать, а лучше превосходить гидрофобность материала концентрирующего он-лайн ТФЭ картриджа.
Только при соблюдении этого условия подвижная фаза способна одновременно обеспечивать и полный, резкий смыв целевых соединений (для чего необходима элюирующая сила не ниже определенного значения), и необходимое удерживание целевых соединений в аналитической колонке (для чего необходима элюирующая сила не выше определенного значения). Отмечу, что нерезкий (в худшем случае – неполный) смыв приводит к сильному уширению пиков (в худшем случае – также потере части целевых соединений); недостаточное удерживание приводит к недостаточному разрешению пиков.
Однако, случаи полного выполнения условия совместимости не так уж часты. Все дело в том, что в обращенно-фазовом режиме более гидрофобный ТФЭ материал обладает большей адсорбционной емкостью. По этой причине нередко гидрофобность материала концентрирующего он-лайн ТФЭ картриджа превосходит гидрофобность материала аналитической колонки. С неизбежной потерей эффективности разделения борются различными хроматографическими способами (увеличение размеров колонки, градиентное элюирование и т.д.)
Непосредственно из первого следует второй недостаток он-лайн ТФЭ – ее экслюзивность, то есть необходимость более индивидуального подхода к разработке ТФЭ процедуры, чем в случае офф-лайн ТФЭ. Нужна большая квалификация аналитика, чтобы найти оптимальный компромисс между приемлемой сочетаемостью он-лайн ТФЭ и аналитической системы, качеством пробы и стоимостью всей системы.
Возможный способ преодолеть оба недостатка заключается в централизованной (например, на базе производителей хроматографической техники) компановки систем он-лайн ТФЭ как под типовые, так и нетривиальные аналитические задачи. Подобные хроматографические системы, разумеется, должны поставляться сразу с методикой, валидированной в рамках той или иной аналитической методики (или методик).


1.6.3. Адсорбционные режимы

1.6.3.1. Как происходит удерживание

Твердофазная экстракция и адсорбционная очистка жидких проб по своей сути являются техниками жидкостной хроматографии. По этой причине основные закономерности выбора адсорбционного материала, а также оптимальных условий нанесения пробы и смыва целевых соединений идентичны закономерностям выбора неподвижной и подвижной фаз в ВЭЖХ.
Чтобы целенаправленно подбирать и оптимизировать условия ТФЭ и АО, необходимо иметь по крайней мере минимальные знания в области физико-химических основ адсорбционных процессов. В этой главе я постараюсь доступно изложить требуемый минимум для аналитика, имеющего базовое химическое образование.
В ТФЭ из газовых сред (и в газовой хроматографии) величина удерживания вещества адсорбционным материалом определяется только взаимодействием между веществом и адсорбционным материалом. Уменьшить это взаимодействие можно только повысив температуру. Таким образом, пробу из газовой фазы необходимо наносить при низкой температуре, а десорбировать летучие целевые соединения при повышенной температуре (т.н. термодесорбция).
В ТФЭ из жидких сред (и в жидкостной хроматографии) величина удерживания вещества адсорбционным материалом определяется разницей между взаимодействием вещества с адсорбентом и взаимодействием вещества с жидкой средой. Таким образом, кроме увеличения температуры, есть по крайней мере еще один способ уменьшить удерживание: увеличить взаимодействие вещества с жидкой средой. Это приводит к компенсации взаимодействия вещества с адсорбентом и, соответственно, уменьшению удерживния.
Осталось только выяснить – как на практике выглядит «увеличение (или уменьшение) взаимодействия вещества с жидкой средой». Фактически, это означает изменение самой жидкой среды. Упрощая, чтобы смыть целевые вещества с адсорбента, необходимо взять такую жидкую подвижную фазу (элюент), которая бы полностью компенсировала адсорбционное взаимодействие вещества с адсорбентом.
При нанесении пробы в ТФЭ решается обратная задача. Необходимо подобрать такой адсорбент, чтобы жидкая среда, в которой приготовлена проба, не могла скомпенсировать взаимодействие целевого вещества с адсорбентом. В этом случае целевые вещества будут поглощаться адсорбентом из жидкой пробы.
Способность жидкой среды к компенсированию взаимодействия вещества с адсорбентом называется элюирующей силой. Закрепим термин на формулировке задачи адсорбционной очистки: в АО адсорбент подбирается таким образом, чтобы жидкая фаза пробы проявляла высокую элюирующую силу по отношению к целевым соединениям и низкую элюирующую силу по отношению к загрязняющим компонентам матрицы. Если подобрать адсорбент соответствующим образом, то целевые соединения будут проскакивать, а компоненты матрицы оставаться на адсорбенте. Надеюсь, здесь все понятно.
Элюирующая сила не является абсолютной характеристикой растворителя или их смеси; она может быть оценена только по отношению к определенному типу адсорбционного материала и, строго говоря, определенному классу целевых веществ. Например, вода обладает самой высокой элюирующей силой при использовании полярного адсорбента и самой низкой элюирующей силой при использовании неполярного адсорбента; это утверждение справедливо практически для любых органических соединений (включая ионизируемые, если адсорбент не содержит ионных или хелатных функциональных групп).
Таким образом, процесс выбора адсорбента и элюента для ВЭЖХ и ТФЭ основан на одних и тех же принципах – различается лишь логика. В ВЭЖХ элюент подбирается так, чтобы он обладал средней, умеренной элюирующей силой; элюент должен смывать целевые вещества ни резко (чтобы они они успели хорошо разделиться) и ни медленно (чтобы не увеличивать время анализа). Напротив, в ТФЭ интерес представляют именно крайние варианты. При нанесении пробы целевые вещества должны полностью поглощаться адсорбентом, а при смыве – резко и полностью десорбироваться.
Комбинацию адсорбента и элюента определенных типов в ВЭЖХ принято называть хроматографическим режимом (LC mode). Существует четыре основных типа адсорбционных режимов разделения, а также т.н. эксклюзионный режим (size exclusion, SE). Все они реализуются и в ТФЭ (с одной оговоркой: в ТФЭ эксклюзионный режим не может быть реализован в чистом виде, он всегда должен сочетаться с адсорбционным режимом).
Четыре адсорбционных режима будем называть следующим образом: нормально-фазовый (normal-phase, NP), обращенно-фазовый (reversed-phase, RP) , ионный и с переносом заряда (charge transfer, CT).
Для каждого адсорбционного режима можно составить список применяемых растворителей или их смесей, расположив их в ряд по возрастанию элюирующей силы. Такой ряд называется элюотропным.
В том случае, когда речь будет идти об удерживании в смешанном режиме, вместо термина «режим удерживания» будем применять термин «механизм удерживания». Вот пример употребления термина «механизм»: «это приведет к увеличению вклада эксклюзионного механизма в смешанном ПЗ/эксклюзионном режиме».
Адсорбент способен поглощать вещества по данному механизму в том случае, когда жидкая среда пробы имеет низкую элюирующую силу по отношению к целевым веществам. Напротив, смыв надо проводить растворителем, обладающем в данном режиме высокой элюирующей силой (по отношению к веществам, которые необходимо смыть).

1.6.3.2. ТФЭ и АО в нормально-фазовом (НФ) режиме

Нормально-фазовый режим реализуется на полярных адсорбентах (силикагель, окись алюминия, флоризил и т.д.). Элюирующая сила растворителей возрастает с их полярностью. Самой низкой элюирующей силой обладают предельные углеводороды, например, гексан. Наиболее высокой элюирующей силой обладают спирты и вода.
Удерживание соединений в нормально-фазовом режиме также определяется полярностью. Чем более полярно соединение, тем больше оно удерживается в нормально-фазовом режиме, и тем более полярный растворитель необходимо использовать для его смыва. Например, для смыва слабополярных полихлорированных бифенилов (ПХБ) применяют 5% раствор дихлорметана в гексане, а для смыва среднеполярных полихлорированных дибензодиоксинов (ПХДД) необходимо применять уже 50% раствор, то есть смесь гексан-дихлорметан 1:1.
Как правило, при использовании нормально-фазового режима в ТФЭ проба представляет собой гексановый экстракт (гексан обладает наименьшей элюирующей силой). Промывка гексаном позволяет удалить неполярные соединения – предельные углеводороды. Иногда применяют промывку смесями гексана с более полярным растворителем (полярной добавкой) для удаления низкополярных компонентов матрицы, прежде всего триглицеридов (жиров). Смыв целевых соединений в большинстве случаев проводят полярным летучим растворителем, например, дихлорметаном, диэтиловым эфиром, ацетоном, этилацетатом и т.д.
В случае АО проба, как правило, представляет собой раствор в полярном органическом растворителе со средним значением элюирующей силы. Целевые соединения не должны быть слишком полярны, чтобы полностью проскочить через слой адсорбента. АО в нормально-фазовом режиме позволяет очистить пробу от наиболее полярных примесей: органических кислот, высокоплярных органических пигментов, полярных природных полимеров и т.д.

1.6.3.3. ТФЭ и АО в обращенно-фазовом (ОФ) и смешанном ОФ/эксклюзионном режимах

Обращенно-фазовый режим, как правло, применяют для ТФЭ различных органических соединений из водных образцов.
ОФ режим реализуется на неполярных адсорбентах: нейтральных полимерных материалах, С18 привитых силикагелях, иногда углеродных материалах. Элюирующая сила растворителей уменьшается с ростом полярности. Самой низкой элюирующей силой обладает вода и водно-солевые системы. Наиболее высокой элюирующей силой обладают среднеполярные органические растворители: ацетонитрил, изопропанол, ТГФ, ацетон и т.д. Теоретически, максимальной элюирующей силой должны обладать предельные и хлорированные углеводороды, например гексан, дихлорметан, но их крайне редкое применение обусловлено несмешиваемостью с водой.
Удерживание соединений в обращенно-фазовом режиме определяется гидрофобностью. Упрощая, чем больше соединение растворяется в воде, тем меньшим удерживанием обладает в ОФ режиме. Малорастворимые в воде вещества удерживаются сильнее всего, и для их смыва приходится применять достаточно неполярные растворители. К примеру, для того, чтобы смыть с нейтрального полистирола замещенные фурфуролы, достаточно смеси ацетонитрила с водой 1:1. Для смыва моноароматических углеводородов необходимо применять ацетонитрил с добавкой изопропанола или ацетона, а для смыва более гидрофобных соединений – чистый ацетон или ТГФ.
Как правило, при использовании обращенно-фазового режима в ТФЭ проба представляет водный обзец, экологический или биологический (вода обладает наименьшей элюирующей силой).
В некоторых случаях допускается наличие в водном образце небольшой доли органического растворителя. В некоторые водные образцы, к примеру, грунтовые воды, специально вносят 5-10% ацетонитрила, чтобы уменьшить адсорбцию неполярных целевых соединений на растворенных природных полимерах – гуминовых кислотах.
Кроме того, ТФЭ в общенно-фазовом режиме можно применить даже в случае неводного образца. Если, к примеру, образец представляет собой ацетонитрильный экстракт, перед ТФЭ в ОФ режиме его необходимо разбавить водой или солевым раствором, доведя долю ацетонитрила до 15-20% и менее. Чем меньше доля ацетонитрила в водном образце – тем больше удерживание целевых веществ и меньше вероятность их проскока.
При ТФЭ биологических образцов, содержащих остаточные белковые соединения, в образец часто добавляют соли (например, сульфат натрия, или фосфаты калия). В условиях повышеной ионной силы агрегаты целевых веществ и белков (к примеру, альбуминов) разрушаются, что приводит к увеличению степеней извлечения. Кроме того, неорганическая соль действует в ОФ режиме как высаливающий агент, повышая удерживание целевых соединений.
Значительная практическая выгода применения ТФЭ достигается при комбинировании обращенно-фазового и эксклюзионного режимов. Смысл применения этого режима заключается в том, что при нанесении пробы целевые низкомолекулярные вещества поглощаются адсорбентом, а полимерные загрязняющие компоненты матрицы проскакивают. Адсорбенты, работающие в смешанных адсорбционно-эксклюзионных режимах, называют адсорбентами с ограниченно доступной поверхностью, ОДП (restricted access media, RAM).
Обращенно-фазовый режим используют и в адсорбционной очистке. Как правило, очищают водные или водноорганические пробы, удаляя из них наиболее гидрофобные соединения: липиды (в т.ч. жиры), детергенты, неполярные пигменты и т.д. Для АО часто применяют С18 и С8 привитые силикагели, которые по гидрофобности уступают полимерным адсорбентам и, соответственно, меньше подходят для ТФЭ и больше – для АО. При необходимости С18 адсорбенты после проведения АО можно регенерировать.

1.6.3.4. ТФЭ и АО в режиме с переносом заряда (ПЗ)

В режиме с переносом заряда удерживанием обладают соединения, имеющие ненасыщенные системы: кратные (двойные, тройные) связи углерод-углерод, карбонильные группы и в особенности ароматические (в т.ч. гетероциклические, в т.ч. замещенные) системы. В целом, чем больше сопряжена ненасыщенная система соединения, тем сильнее оно удерживается в ПЗ режиме.
Удерживание по ПЗ механизму происходит на адсорбентах, также содержащих ненасыщенные структурные фрагменты, или же ионы (атомы, комплексы) переходных металлов, чаще серебра. Адсобенты с переходными металлами (чаще применяют серебро) лучше удерживают вещества с двойными и тройными связями (олефины, ненасыщенные жирные кислоты и триглицериды). Адсобенты с ароматическими фрагментами лучше удерживают ароматические соединения.
Наибольший вклад ПЗ механизм имеет в неполярных жидких средах. Нередко, когда адсорбент достаточно полярен, можно наблюдать смешанный ПЗ/НФ режим. Однако, элюотропный ряд растворителей для ПЗ режима достаточно сильно отличается от такового для нормально-фазового режима.
Как и в НФ режиме, самой низкой элюирующей силой обладают предельные углеводороды (гексан). Основное отличие от НФ режима достаточно низкой элюирующей силой обладают спирты. Примесь влаги так же не влияет на удерживание в ПЗ режиме (в отличие от НФ режима, где примесь влаги резко снижает удерживание, поскольку вода обладает максимальной элюирующей силой). Наиболее высокой элюирующей силой в ПЗ режиме обладают хлорированные углеводороды (дихрорметан) и кетоны (ацетон). В отличие от НФ режима, высокой элюирующей силой обладают также ароматические углеводороды (толуол).
Как было отмечено, удерживание соединения в ПЗ режиме в первом приближении можно связать со степенью сопряженности его ненасыщенной (π-электронной) системы. Так, для десорбции со сверхсшитого полистирола (ССПС) моно- и биароматических углеводородов, полихлорированных бифенилов (ПХБ) вполне достаточно гексана, то есть растворителя с минимальной элюирующей силой. Для того, чтобы смыть три- и тетрациклические полиароматические углеводороды (ПАУ), полихлорированные дибензофураны (ПХДФ), необходимо применять 10% раствор дихлорметана в гексане. Чтобы смыть пентациклические ПАУ (например, бензапирен), необходим 20% раствор дихлорметана в гексане.
Как правило, при использовании режима с переносом заряда в ТФЭ проба представляет собой гексановый экстракт; допустимы небольшие добавки спиртов (гексан и спирты обладают низкой элюирующей силой). Промывка гексаном или гексаном с небольшой добавкой спиртов позволяет удалить ненасыщенные соединения, в том числе предельные углеводороды, а также (если только речь не идет об адсорбентах с серебром) основную часть триглицеридов. Смыв целевых соединений в большинстве случаев проводят дихлорметаном, ацетоном или их смесями с гексаном.
Адсорбционная очистка в ПЗ режиме применяется, по всей видимости, достаточно редко. Наиболее известным случаем является адсорбционное удаление из гексановых экстрактов элементной серы и серусодержащих соединений на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра.

1.6.3.5. ТФЭ в ионном и смешанном ионном/ОФ режимах

В ионном режиме удерживанием обладают соединения, имеющие положительный или отрицательный электрический заряд, то есть существующие (или способные существовать в определенном диапазоне рН среды) в виде органических ионов. В ТФЭ ионный или смешанный ионный/обращенно-фазовый режимы наиболее часто применяют для экстракции ионизируемых органических соединений: органических оснований и органических кислот.
Удерживание по ионному механизму происходит на адсорбентах, содержащих заряженные функциональные группы. Адсорбенты, несущие положительно заряженные группы (как правило, четвертичные аммониевые), имеют положительный заряд и удерживают анионы; это адсорбенты будем называть аниононитами. Адсорбенты, несущие отрицательно заряженные группы (как правило, сульфогруппы), имеют отрицательный заряд и удерживают катионы; это адсорбенты будем называть катионитами.
Упомянутые адсорбенты (катиониты с сульфогруппами и аниониты с четвертичными аммонийными) называют сильными в том смысле, что их заряд и, следовательно, емкость, остаются неизменно высокими в широком интервале рН. Иониты, которые обладают максимальной емкостью лишь в достаточно узком диапазоне рН, называют слабыми. Распространенным слабым анионитом является аминофаза (адсорбент с аминопропильными группами).
В большинстве случаев в ТФЭ применяют сильные иониты. Слабые иониты в основном используют для экстракции многозарядных соединений; в этом случае сколонные к высокому удерживанию целевые соединения могут быть смыты достаточно легко и в мягких условиях.
Как правило, при использовании ионного режима в ТФЭ проба представляет собой водный или водноорганический образец. Если целевые соединения не являются ионами при любом рН, то есть являются ионизируемыми соединениями, то перед экстракцией рН обраца доводят до значения, при котором они в большой степени или полностью ионизированы. Таким образом, органические основания наносят из их растворов в кислоте, а органические килоты – из их растворов в щелочи.
При использовании слабых ионитов необходимо помнить, что их емкость максимальна в достаточно узком интервале рН, который, к тому же, не совпадает с рН, в котором ионизируются потенциальные целевые соединения. По этой причине слабые иониты применяют только для экстракции органических ионов, имеющих заряд в широком диапазоне рН. При этом, рН образца доводят до того значения, при котором ионизирован (и имеет максимальную емкость) сам ионит.
В тех случаях, когда применяемые иониты гидрофобны, удерживание из водных или водноорганических образцов происходит по смешанному ионному/обращенно-фазовому механизму. Достаточно высокой гидрофобностью обладают иониты на полимерной основе, в особенности на основе полистирола. Вклад обращенно-фазового механизма характерен для целевых соединений, имеющих большие углеводородные структурные фрагменты, поскольку их гидрофобность даже в ионизированном состоянии достаточно высока.
Состав элюента для смыва целевых соединений во многом зависит от их структуры. Есть два основных случая. Во-первых, целевые соединения могут являться ионизируемыми соединениями, то есть иметь как ионную, так и молекулярную формы (органические кислоты и основания). Здесь элюирование целевых соединений основано на переводе целевых соединений в незаряженную молекулярную форму. Таким образом, для того, чтобы смыть органические кислоты, применяют кислоту, а чтобы смыть органические основания – щелочь или аммиак.
Поскольку удерживание часто обусловлено комбинацией ионного и обращенно-фазового механизмов, в качестве основы элюента, как правило, выбирают полярный органический растворитель, например, ацетонитрил. В основу делают небольшую, порядка 10%, добавку водного концентрированного раствора летучей кислоты (например, соляной, муравьиной) для смыва органических кислот, или аммиака для смыва органических оснований. Применение именно летучих добавок хорошо тем, что позволяет отогнать избыточный растворитель из элюата в токе азота и, таким образом, дополнительно сконцентрировать пробу (это допустимо только для нелетучих целевых соединений!). Если вклад ОФ механизма невелик, то смыв кислот можно проводить чистой органической летучей кислотой, например, муравьиной.
Во-вторых, целевые соединения могут являться органическими ионами в широком диапазоне рН, то есть не иметь молекулярной незаряженной формы (к примеру, бетаины). В этом случае элюирование основано на принципе ионного обмена – вытеснения избытком другого одноименно заряженного иона. Фактически, смыв в этом случае осуществляется водным раствором соли достаточно высокой концентрации 1-3 моль/л. К примеру, для смыва анионов часто применяют концентрированный фосфатный буфер.

1.6.4. Адсорбционные материалы для ТФЭ и АО; варианты их применения в различных адсорбционных режимах

1.6.4.1. Органические полимерные адсорбенты: нейтральные и бифункциональные. Углеродные материалы

До сравнительно недавнего времени (точнее, до конца 90-х годов) неорганические адсобенты, включая привитые адсорбенты на силикагеле, являлись фактически единственными адсорбционными материалами для твердофазной экстракции. В очень редких случаях в этих целях применялись пористые полистирол-дивинилбензольные (ПС-ДВБ, PS-DVB) смолы типа Amberlite XAD-1-4.
В настоящее время для ТФЭ применяют в основном полимерные адсорбционные материалы. К их неоспоримым преимуществам относятся гидролитическая стабильность и возможность регенерации (соответственно, многократного использования). Более того, нейтральные (без функциональных групп) полимерные адсорбенты при экстракции из водных образцов в ОФ режиме обладают на один-два порядка большим удерживанием, чем С18 привитые силикагели. По этой причине С18 силикагели в ОФ режиме стали чаще применять не для ТФЭ, а для адсорбционной очистки.
Нейтральные полимерные материалы приобрели большую популярность в ТФЭ в первую очередь как т.н. универсальные адсорбенты (generic аdsorbent), то есть применяемые для извлечения из водных образцов в ОФ режиме как можно более широкого спектра соединений различных классов и/или их многократного концентрирования.
Рассмотрим более детально вопрос зависимости адсорбционных свойств нейтральных полимерных материалов от их структурных и химических характеристик. К структурным можно отнести такие принципиально важные для ТФЭ порлимерных адсорбентов характеристики как распределение пор по размеру и жесткость полимерной сетки. К химическим характеристикам относят гидрофобность/гидрофильность у нейтрального адсорбента и наличие функциональных групп у бифункционального.
Распределение пор по размеру зависит от условий синтеза полимера. По размеру поры можно разделить на транспортные 1000-2000 Å, истинные 60-300 Å (в совокупности истинные и транспортные поры обозначают термином «макропоры») и молекулярные псевдопоры, образованные полимерной сеткой («микропоры») 20-30 Å.
Адсорбент может обладать либо только одним видом пор, либо может сочетать разные виды пор. Адсорбенты, обладающие только микропорами, называют микропористыми. Адсорбенты, обладающие по крайней мере одним видом макропор, называют макропористыми. Адсорбенты, сочетающие макро- и микропоры, иногда называют бипористыми. Наконец, адсорбенты, обладающие только транспортными порами, иногда называют мегапористыми, и адсорбенты без пор называют непористыми – однако, они не применяются в ТФЭ (только в ВЭЖХ), поскольку обладают низкой емкостью.
Выбор материала с тем или иным распределением пор по размеру определяется спецификой решаемой аналитической задачи. К примеру, микропористые адсорбенты являются ОДП материалами, поэтому часто применяются для экстракции из образцов, загрязненных полимерными компонентами матрицы.
Жесткостью полимерной сетки определяется совместимость полимерного адсорбента с различными органическими растворителями и водой. Чем жестче сетка, тем лучше – адсорбент не набухает в термодинамически «хороших» растворителях и не сжимается в термодинамически «плохих». За жесткость полимерной сетки отвечает параметр, называемый степенью сшивки. Адсорбенты низкой степени сшивки в ТФЭ не используют; широкое применение нашли полимерные адсорбенты средней (около 50%), высокой (до 100%) степени сшивки и сверхсшитые (>100%) полимеры. Степенью сшивки от средней до высокой обладают большинство адсорбентов для ТФЭ: на основе полистирол-дивинилбензола (ПСДВБ), полистирол-поливинилпирролидона (ПСПВП), полиакрилатов; сверхсшитыми являются в основном полистирол-дивинилбензолы.
Примечательно, что успех полимерных адсорбентов для ТФЭ большей частью обязан появлению на рынке высокосшитых и сверхсшитых материалов. Бум научных публикаций по ТФЭ пришелся на конец 90-х и начало 2000-х годов. Еще более интригующим является факт, что сверхсшитые материалы являются отечественной разработкой.
Еще в 1970-х годах В.А. Даванков и М.П. Цюрупа интенсивной сшивкой полистирола в присутствии термодинамически «хорошего» растворителя, предотвращающего фазовый распад системы, впервые получили жесткие микропористые полимерные материалы, практически одинаково набухающие и способные работать в любых жидких средах. Этому типу полимерных сеток и адсорбционных материалов было предложено название «сверхсшитые» (hypercrosslinked). Отличительными признаками сверхсшитых адсорбентов является высокая жесткость сетки и исключительно высокая удельная поверхность (порядка 1000 м2/г и выше). Сверхсшитые полистиролы (ССПС) могут быть микропористыми и бипористыми (с транспортными порами).
Достаточно перспективными материалами для ТФЭ являются активированные угли и сажи. Удельная поверхность этих материалов может варьироваться в широких пределах в зависимости от технологии их изготовления: от 10 м2/г для непористых саж до 1000 м2/г для различных марок активированных углей (в ТФЭ применяют в основном угли с небольшой удельной поверхностью). Сажи, выпускаемые для твердофазной экстракции, графитируют при высокой температуре для гомогенизации поверхности и удаления остаточных полярных групп. Угли же всегда содержат некоторое количество полярных групп.
Главным недостатком углеродных адсорбентов является затрудненная десорбция (смыв) аналитов, что ограничивает их интенсивное применение. Для более полного и резкого смыва аналитов с такого рода материалов можно применять горячие высококипящие растворители, например, толуол; в этом случае, однако, адсорбент должен быть помещен в небольшую колонку или картридж из стекла (не из полипропилена или иной пластмассы).
Нейтральные высокосшитые полимеры и углеродные материалы применяют в ТФЭ как для адсорбции летучих веществ из газообразных образцов, так и для экстракции из любых типов жидких образцов.
Все типы нейтральных полимерных и углеродных материалов способны эффективно адсорбировать вещества различных групп из водных и водноорганических жидких сред по обращенно-фазовому механизму. Это их основное применение, именно за эффективную экстракцию в ОФ режиме данные адсорбенты получили всеобщее признание.
Сверхсшитые полистиролы (ССПС) и углеродные материалы хорошо адсорбируют ароматические соединения из гексановых растворов и экстрактов по механизму с переносом заряда. Для микропористых материалов значительную роль приобретает эксклюзионный механизм.

1.6.4.2. Полярные неорганические адсорбенты: силикагель и привитые силикагели, окись алюминия. Импрегнированные адсорбенты

Неорганические полярные адсорбенты (в основном силикагель и окись алюминия, реже привитые амино- и нитрил- силикагели и флоризил) остаются популярными материалами для адсорбционной очистки по нормально-фазовому механизму; не последняя причина здесь – сравнительная дешевизна этих адсорбентов, что позволяет использовать их однократно.
Часто для ускорения процедуры АО проводят не динамическим, а статическим методом, добавляя адсорбент в экстракт, а затем отделяя его от экстракта простым декантированием или центрифугированием.
АО на полярных неорганических адсорбентах проводят из жидких сред с полярностью от низкой до средней, то есть от гексана с определенной долей полярной добавки до чистых органических растворителей средней полярности (дихлорметан, диэтиловый эфир, ацетон и т.д.). Главное требование – в выбранных условиях целевые вещества должны гарантированно проскакивать, или, если очистку проводят в статических условиях, не поглощаться адсорбентом в сколько-нибудь значительных количествах.
При обработке пробы на полярных адсорбентах параллельно происходит ее доосушение, то есть адсорбент поглощает влагу, оставшуюся после сушки пробы над безводным сульфатом натрия. Удаление адсорбентом остаточной влаги – это бесспорное благо именно при проведении адсорбционной очистки. Для твердофазной экстракции это не очень хорошо, поскольку свойства адсорбента изменяются прямо при наненении пробы, что грозит невоспроизводимостью результатов всей процедуры. Это соображение еще раз свидетельствует в пользу применения полярных адсорбентов в АО и против их применения в ТФЭ.
С другой стороны, любые полярные адсорбенты, в особенности силикагель, очень часто используются для очистки пробы проведением колоночной хроматографии низкого давления (на небольшой стеклянной колонке с крупнозернистым адсорбентом, см. гл. «колоночная ЖХ низкого давления»).
Полярные неорганические адсорбенты очень хорошо поглощают влагу из воздуха. Поэтому необходимо соблюдать правила их хранения (см. Приложение). Этого бывает вполне достаточно, если для работы закупается достаточно дорогой «фирменный» адсорбент марки «для колоночной хроматографии», или же непосредственно готовые картриджи с адсорбентом.
Если адсорбенты не такие дорогие и чистые, то перед применением их необходимо должным образом термически обработать (см. Приложение). Ни в коем случае нельзя применять адсорбенты из старых банок, доставшихся «в наследство».
Несколько особый случай представляет собой окись алюминия. Этот материал обладает большой адсорбционной и даже каталитической активностью. Кроме правильной термообработки и хранения, перед применением окись алюминия необходимо особым образом кондиционировать (см. Приложение), чтобы обеспечить определенную, не слишком большую величину адсорбционной активности. Некачественная и/или неправильно приготовленная окись алюминия может стать причиной потери аналитов за счет необратимой хемосорбции или каталитического разложения. В то же время, окись алюминия является наиболее полярным адсорбентом, очень хорошо подходящим для фракционирования проб, содержащих слабополярные целевые соединения (которые, как правило, имеют невысокое удерживание в НФ режиме).
Действие флоризила, напротив, отличается «мягкостью». Этот адсорбент применяют в том случае, когда существует риск потерять целевые вещества, к примеру, если они являются органическими основаниями и/или способны к хелатированию переходных металлов (примесь которых всегда есть в силикагеле и особенно в окиси алюминия).
Большое значение для адсорбционной очистки имеют т.н. импрегнированные адсорбенты, которые получают нанесением на исходный полярный адсорбент того или иного реагента. Как правило, основой для импрегнированных адсорбентов служит силикагель. Такие асдорбенты отдельно готовят (см. Приложение), а перед применением переносят в небольшие стеклянные колонки (это не значит, что проводят колоночную хроматографию; здесь стеклянная колонка – это просто вид картриджа для обычной адсорбционной очистки). Все импрегнированные полярные адсорбенты применяют в достаточно неполярных жидких средах.
Наиболее распространенные реагенты для импрегнирования – это кислоты (серная, фосфорная), щелочи (гидроксид калия) и нитрат серебра.
Силикагель с гидроксидом калия применяют для удаления из неполярных экстрактов кислотных компонентов матрицы, в том числе природных полимерных гуминовых кислот.
Силикагели с нанесенными кислотами обладают менее селективным и более мощным воздействием. Они не только удаляют компоненты матрицы с основными свойствами; эти материалы обладают заметной каталитической активностью и способны разлагать и поглощать вещества различных классов. Наиболее «жестким» воздействием обладает силикагель с серной кислотой, более «мягким» - силикагель с фосфорной кислотой. Как правило, выбирают наиболее жесткий вариант очистки, который способны выдерживать целевые соединения.
Силикагель с нитратом серебра применяют в режиме с переносом заряда для удаления различных ненасыщенных и других сильно поляризуемых соединений, в том числе элементной серы. В колоночной хроматографии этот адсорбент используют, к примеру, в смешанном НФ/ПЗ режиме для предварительного фракционирования нефтей.
На основе силикагеля путем химической прививки получают не только полярные, но и неполярные адсорбенты: С4, С8 и С18 фазы. Они применяются в основном для адсорбционной очистки в ОФ режиме.

1.6.4.3. Адсорбенты с ограниченно доступной поверхностью (ОДП) различных типов

1.6.4.4. Высокоселективные аффинные и импринтные адсорбенты

1.6.5. Разработка процедуры ТФЭ: практика и теория

Разработка процедуры ТФЭ начинается с принципиальной идеи – как решить поставленную задачу, проведя экстракцию в определенном адсорбционном режиме и на определенном адсорбенте (или типе адсорбента). Остальное, как говорят, составляет лишь «технические моменты». Об этих моментах в данной главе и пойдет речь.
Главное в ТФЭ – это избежать потерь целевых соединений – как на стадии нанесения пробы, так и на стадии смыва веществ с адсорбента. Вторая задача – создать возможность для нанесения как можно большего объема пробы, чтобы получить большую степень концентрирования. Третья задача – обеспечить (параллельно с концентрированием) возможность очистки пробы от компонентов матрицы в процессе ТФЭ. Наконец, четвертая задача – оптимизировать состав элюента таким образом, чтобы он не только хорошо смывал целевые вещества, но также подходил для следующего шага аналитической процедуры без проведения каких-либо дополнительных манипуляций (таким шагом может быть, к примеру, введение элюата напрямую в хроматограф, то есть элюат может быть и конечной пробой).
Для решения каждой из этих задач необходимо провести ряд тестов: с адсорбентом, модельными растворами и реальными образцами.
Начнем с самого сложного – с первой части первой задачи. Итак, как разработать надежную процедуру ТФЭ, в которой целевые соединения гарантированно бы не терялись на стадии нанесения пробы? Рассматриваем динамический метод нанесения, где пробу пропускают через картридж с адсорбентом.
Потеря целевого вещества происходит тогда, когда заметное его количество проскакивает через адсорбент и появляется в элюате. Что значит заметное? В принципе, здесь нет четкого определения, но часто считают, что если концентрация целевого в элюате достигает 10% от его концентрации в пропускаемой пробе – это уже заметное количество. Если дальше пропускать пробу, то мы получим ощутимую потерю целевого соединения.
Объем пробы, который удается пропустить через картридж до момента проскока, то есть до момента, когда концентрация целевого в элюате достигает 10% от концентрации в пробе, называют объемом проскока. Объем проскока – это очень частная характеристика, которая зависит буквально от всего: адсорбента, размера картриджа, скорости потока, растворителя пробы - а также индивидуального состава каждой конкретной пробы. В методике нельзя прос то указать некоторый объем проскока, полученный для какого-либо модельного образца, как рекомендуемый объем наносимой пробы – это не вполне корректно.
Поступают следующим образом: проводят ряд испытаний на модельных образцах, а также, желательно, и на нескольких типичных реальных пробах. Получают некоторый диапазон объемов проскока. Далее, закладывают в методику некоторый запас прочности, деля минимальный объем проскока, допустим, на два – это и будет рекомендуемый объем наносимой пробы.
Испытания начинают проводить на модельных образцах. Модельные образцы, условно, бывают двух видов. Во-первых, это может быть просто очень разбавленный раствор целевлого соединения в чистом растворителе, моделирующем пробу. Например, если собираются экстрагировать водные образцы, то готовят модельный образец в воде. Если целевое соединение достаточно гидрофобное, то в воду дозируют очень малую аликвоту раствора целевого, допустим, в ацетонитриле или спирте. Для удобства в этой главе будем называть такие модельные пробы «в чистом растворителе» растворами первого типа.
Модельную пробу можно сделать более похожей на реальную, добавив в нее какие-либо характерные компоненты матрицы или моделирующие их соединения – причем можно сделать несколько растворов с различной концентрацией моделирующих матрицу веществ (варьировать же концентрацию целевого соединения не имеет никакого смысла, поскольку его в пробе содержится на порядки меньше, чем компонентов матрицы). В конце концов, можно приготовить модельные растворы на основе произвольной реальной пробы. Назовем все подобные модельные пробы «с компонентами матрицы» растворами второго типа.
Эксперименты с модельными растворами достаточно просты: с некоторой скоростью их пропускают через картридж, измеряя при этом концентрацию целевого соединения в элюате. Фактически, этот эксперимент является фронтальным хроматографированием (то есть когда пробу непрерывно подают в колонку). «Пик» вещества здесь выходит в виде S-образной ступени, которую в данном случае называют кривой проскока (breakthrough curve). Объем пропущенной пробы, соответствующий одной десятой высоты этой ступени, и есть объем проскока.
Для картриджей с большей хроматографической эффективностью, которые меньше размывают хроматографическую зону, подъем S-образной ступени более крутой (что соответствует более узкому пику в обычной хроматографии). У менее эффективного картриджа подъем пологий, то есть к моменту формального проскока на неэффективном картридже фактически теряют больше целевого соединения, чем на эффективном.
Кривые проскока получают двумя основными способами. Один способ универсальный, но менее удобный: элюат разбивают на фракции, а целевое вещество определяют в каждой фракции любым подходящим методом. Второй способ состоит в применении обыкновенного изократического хроматографа с УФ детектором: ТФЭ картридж устанавливают вместо колонки, а модельный раствор используют вместо элюента.
Второй способ, конечно, имеет свои ограничения: целевое вещество должно хорошо поглощать в УФ диапазоне, а внесенные в раствор компоненты матрицы, наоборот, не должны быть видны. Как правило, это способ применяют для работы с модельными растворами первого типа, то есть растворами целевого вещества «в чистых растворителях». Например, он очень удобен для проведения предварительного эксперимента по сравнению нескольких картриджей с различными марками адсорбентов для того или иного приложения.
Сначала получают кривые проскока для модельного раствора без компонентов матрицы, а затем для растворов с матрицей – в порядке увеличения концентрации внесенных компонентов. Будет видно, что при увеличении концентрации веществ матрицы, нагружающих картридж, объем проскока будет уменьшаться, а форма S-образной ступени будет становиться более пологой. Этот эффект хорошо известен газовым хроматографистам и жидкостным хроматографистам, имеющим опыт в препаративной ВЭЖХ: при увеличении общей нагрузки на колонку времена удерживания веществ уменьшаются, а сами пики уширяются.
Результаты данных экспериментов не только позволяют установить некоторое надежное, рекомендуемое в методке значение объема наносимой пробы. Они также дают возможность целенаправленно варьировать условия проведения ТФЭ для различных матриц. К примеру, для насыщенных матриц – уменьшать объем наносимой пробы, или увеличивать объем адсорбционного картриджа, или снижать скорость нанесения пробы. Чем тщательнее проведено исследование, тем больше у аналитика окажется инструментов для устранения возникающих (время от времени, на тех или иных пробах) артефактов.
По поводу зависимости объема проскока от концентрации нагружающих компонентов позволю себе небольшую ремарку, которую оценят любители теории. В хроматографии есть термин «емкость». Раньше он, скорее, обозначал удерживание; к примеру, современный термин «фактор удерживания» для обозначения k’ = t’/t0 в прошлом был «фактором емкости». Хотя, конечно, «емкость» интуитивно воспринимается как способность материала адсорбировать некоторое количество вещества. В этом случае этот параметр, конечно, связан с удерживанием, но более сложной зависимостью, и является только одним из многих других факторов, на удерживание влияющих. Одним словом, в общем случае емкость не определяет удерживание напрямую.

Переходим ко второй части первой задачи – как избежать потерь при смыве целевых веществ? Здесь лучшие результаты – за он-лайн ТФЭ; в этой реализации весь элюат поступает непосредственно в колонку. Для офф-лайн ТФЭ для проверки потерь при смыве надо получить «кривую проскока наоборот», то есть кривую десорбции. Положительный момент здесь состоит в том, что необходимый объем элюента мало зависит от свойств конкретных проб, поэтому достаточно провести всего один эксперимент.
Для достижения максимальной полноты смыва может потребоваться достаточно большой объем элюента, с которым будет трудно работать; к тому же, проба окажется более разбавленной. Поэтому есть некоторый оптимум между потерями целевых при смыве и объемом элюата. В своих подходах я иногда предлагаю два значения для объема элюента: больший для более полного смыва и меньший для меньшего объема элюата. Если анализ проводится с применением внутренних стандартов-суррогатов, то имеет смысл пренебречь некоторыми потерями и выбрать вариант с меньшим объемом элюата.
Вторая задача: как увеличить объем проскока? Самый простой путь – это путь экстенсивный, то есть применять картриджи с большим количеством адсорбента. Конечно, при таком подходе и объем элюента придется увеличить пропорционально. При работе с водными образцами можно, как в случае ЖЭ, применять высаливание, то есть добавлять в пробу неорганическую соль. В некоторых случаях имеет смысл снизить скорость пропускания образца.
Третья задача – очистка в дополнение к концентрированию – решается, как правило, выбором селективных условий промывки картриджа перед элюированием целевых соединений. Здесь надо действовать достаточно аккуратно, чтобы избежать ненужных потерь. Тонкая подстройка условий промывки помогает в том случае, когда удерживание основных компонентов матрицы в выбранном режиме меньше удерживания целевых соединений. Более удерживаемые компоненты матрицы, не элюирующиеся вместе с целевыми соединениями на стадии смыва, удаляют с картриджа уже на стадии регенерации.