Главы 1.1-1.2. Техники подготовки пробы для ВЭЖХ и ГХ

[Константин Сычев]

Поставка ВЭЖХ оборудования Agilent и Gilson http://www.chromforum.ru/viewforum.php?f=47

1.1. Предварительная обработка проб

Существует всего несколько основных техник предварительной обработки проб. Их применение, как правило, достаточно очевидно и следует из здравого смысла.
До того, как взять навеску, которая является частью всего отобранного для анализа образца, данный образец необходимо усреднить.
Нередко для корректного усреднения образца его предварительно механически измельчают. Степень измельчения во многом зависит от навески; чем тоньше размолот образец, тем меньшую навеску можно взять, не ухудшив точности анализа.
Если определение нужно провести в осушенном образце, то сначала сушат образец, затем его усредняют, и только затем берут навеску.
В том случае, когда образец состоит из жидкой фазы и осадка, сначала фильтрованием или центрифугированием отделяют осадок. Жидкая и твердая части образца экстрагируются раздельно. Одна из частей может быть отброшена, то есть не подвергаться экстрагированию, в том случае, если она гарантировано не может содержать целевые вещества в значимых количествах.
Экстракцию суспензий и эмульсий допустимо осуществлять напрямую; однако, в ряде случаев целесообразно разрушать дисперсную фазу до экстракции (см. гл. «Разрушение эмульсий и коагуляционных структур»). Окончательное решение по этому вопросу принимает аналитик.


1.2. Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ)

1.2.1. Основы метода ЖЖЭ

Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – это экстракционная техника, основанная на переводе веществ из одной жидкой фазы в другую при их непосредственном контакте; жидкие фазы не должны смешиваться, то есть их взаимная растворимость должна быть очень мала.
Многократная последовательная экстракция несколькими порциями экстрагента значительно эффективнее, чем однократная всем объемом экстрагента сразу. Поэтому, как правило, весь объем экстрагента делят на несколько частей (например, три) и проводят несколько последовательных процедур ЖЖЭ; экстракты затем объединяют.
Распределение растворенных веществ между двумя жидкими фазами определяется их полярностью. В частном случае, когда одной из фаз является вода, можно говорить о «гидрофобности» веществ.
Гидрофобными считают вещества, которые плохо растворяются в воде и хорошо – в несмешивающихся с водой органических растворителях, к примеру, петролейном эфире, минеральном масле. Гидрофильные вещества, напротив, отлично растворимы именно в водных средах.
При соприкосновении двух фаз, водной и органической, растворенные в них гидрофильные вещества преимущественно переходят в водный слой, а гидрофобные – в органический слой. Через некоторое время для каждого из веществ, распределенных между одной и другой фазой, устанавливается равновесие. Отношение концентрации вещества в одной фазе к его концентрации в другой фазе называется коэффициентом распределения.
Поскольку жидкость-жидкостная экстракция является равновесным процессом, то даже теоретически невозможно добиться полного извлечения вещества из одной фазы в другую. Однако, при выборе подходящего экстрагента и примененении многократной экстракции можно добиться значительной, более 90%, степени извлечения целевого вещества.
Для ионизируемых веществ, диссоциирующих в водных средах, «гидрофобность» также зависит от соотношения концентраций молекулярной (незаряженной) и ионной (заряженной) форм. Ионная форма лучше растворима в воде и поэтому менее гидрофобна. Чтобы при поможи ЖЖЭ извлечь ионизируемое вещество из водной фазы в органическую, необходимо подавить его диссоциацию, то есть перевести как можно большую часть вещества в незаляженную (то есть более гидрофобную) молекулярную форму.
Если извлекаемое вещество является органической кислотой, то перед экстракцией рН ее водного раствора необходимо понизить при помощи добавки сильной неорганической кислоты; рН должен быть по крайней мере на 2 единицы ниже рКа извлекаемой органической кислоты. В том случае, если извлекаемое вещество является органическим основанием, то перед экстракцией рН его водного раствора необходимо повысить при помощи добавки сильной щелочи или аммиака; рН должен быть по крайней мере на 2 единицы выше рКа извлекаемого органического основания.
Добавка неорганической соли в водную фазу приводит к увеличению эффективности экстракции растворенных в ней веществ. Этот эффект называется высаливанием. Для высаливания часто применяют самую дешевую соль – поваренную, дополнительно очищенную перекристаллизацией. Однако, многие специалисты имеют свои «секретные», более эффективные составы солей для высаливания. В них могут входить: хлорид кальция или сульфат магния (но не одновременно), сульфат натрия, перхлорат лития и тот же хлорид натрия.
Эффективность экстракции из воды во многом зависит и от применяемого органического растворителя-экстрагента. Насыщенные углеводороды и подобные им вещества лучше экстрагируются гексаном (петролейным эфиром, циклогексаном, изооктаном). Ароматические углеводороды и ароматические вещества в целом – дихлорметаном, толуолом. Полярные кислородсодержащие вещества эффективно извлекаются сложными и простыми эфирами (этилацетат, диэтиловый эфир). Применение в качестве экстрагентов смесей органических растворителей для ЖЖЭ нехарактерно.
Немаловажно, чтобы органический растворитель для экстракции обладал по возможности низкой температурой кипения, до 60°С. Такие растворители удобно удалять отгонкой (см. гл. «Концентрирование пробы отгонкой растворителя»). Этим способом концентрируют полученный экстракт или же выделяют проэкстрагированные вещества в виде сухого остатка. Наиболее легкокипящими растворителями являются диэтиловый эфир и дихлорметан; наиболее тяжело отгоняется высококипящий толуол.
Для ускорения жидкость-жидкостной экстракции фазы должны достаточно активно перемешиваться (по крайней мере, в течении нескольких минут). Если ЖЖЭ проводить вручную в делительной воронке, совершенно необязательно проводить встряхивание непрерывно. Достаточно сделать несколько энергичных встряхиваний с промежутками в полминуты; перед каждым очередным встряхиванием необходимо стравливать давление в делительной воронке.
Наиболее неприятным с технической точки зрения эффектом, в ряде случаев ограничивающим применение жидкость-жидкостной экстракции, является образование в результате встряхивания третьей, дисперсной фазы: эмульсии или, в худшем варианте, достаточно устойчивой коагуляционной структуры – геля. Для разрушения дисперсной фазы применяют различные подходы (см. гл. «Способы разрушения эмульсий и коагуляционных структур»).


1.2.2. Применение ЖЖЭ в пробоподготовке. Преимущества и недостатки ЖЖЭ

ЖЖЭ применяют как с целью получения первоначального экстракта, так в целях дополнительной обработки проб.
Первоначальную экстракцию методом ЖЖЭ очень часто применяют для извлечения органических соединений из водных образцов. Основной целью здесь является перевод целевых содинений в фазу более летучего и менее полярного по сравнению с водой органического растворителя.
Жидкость-жидкостной экстракцией из водных образцов большого объема порядка 0.1-2 л небольшими объемами экстрагента порядка 3 х 5-15 мл можно достичь значительной степени концентрирования до 1:100. Если целевые соединения нелетучи, то степень концентрирования можно увеличить путем отгонки растворителя из полученного экстракта.
Этот подход, однако, также ограничен степенью насыщенности исходного водного образца компонентами матрицы. Поскольку ЖЖЭ обладает сравнительно низкой селективностью, значительная часть компонент матрицы переходит вместе с целевыми соединениями в экстракт. Попытка отогнать растворитель из такого экстракта может привести к выпадению осадка, загустеванию т.д., то есть к потере экстрактом гомогенности. По этой причине ЖЖЭ из больших объемов водных образцов бывает успешна для сравнительно «чистых» образцов и проблематична для «грязных».
К очень проблематичным можно причислить морально устаревший подход с использованием ЖЖЭ для первоначальной экстракции различных соединений из гидролизатов жира и жиросодержащих продуктов. Как правило, все заканчивается получением вместо «чистого» экстракта устойчивого геля, который сложно разрушить даже специальными методами.
Типичными экстрагентами для ЖЖЭ из водных образцов являются гексан (верхний слой) и хлористый метилен (нижний слой). Реже, в основном для экстракции наиболее полярных соединений, применяют этилацетат и диэтиловый эфир.
ЖЖЭ также применяют и для извлечения полярных органических веществ из образцов в углеводородных растворителях: гексане, циклогексане, изооктане. В качестве экстрагентов применяют полярные несмешивающиеся с гексаном растворители: ацетонитрил, ДМСО, ДМФА – а также смеси ацетонитрила с водой в различном соотношении.
Так, классическим способом выделения полярных и полиароматических соединений из гексановых экстрактов, содержащих жиры и высшие углеводороды, является жидкостная экстракция гексаном. Конечно, этот метод неселективен, и коэффициенты извлечения зависят от типа матрицы, однако он прост, чего в ряде случаев бывает достаточно.
ЖЖЭ нередко применяют и для очистки проб. К примеру, для удаления из гексановых экстрактов, содержащих неполярные целевые соединения, сопутствующие соединения основного характера экстракт промывают водным раствором фосфорной (реже серной) кислоты; для удаления соединений кислого характера применяют раствор аммиака. Промывкой водного экстракта с полярными целевыми соединениями гексаном можно удалить неионные детергенты.
Определенные трудности с количественным извлечением методом ЖЖЭ могут возникнуть в том случае, когда целевые соединения способны связываться с компонентами матрицы за счет межмолекулярных сил.
Первым типичным примером является ЖЖЭ из плазмы крови полярных биологически активных соединений, которые нередко бывают в значительной степени связаны с транспортными белками, альбуминами, которые в данном случае являются компонетами матрицы. Связывание происходит за счет «полярных» взаимодействий: электростатических, водородных связей и т.д. Целевые соединения в принципе способны раствориться в водной среде экстрагируемого образца – необходимо лишь разрушить взаимодействия, связывающие их с белками. Это достигается в основном высаливанием, то есть добавлением в образец сильных электролитов. Если целевые соединения ионные, то вместе с этим необходимо изменить рН образца для перевода аналитов в молекулярную форму.
Существует вариант высаливания, когда весь жидкий образец (например, плазма крови) после изменения рН растирается с безводной солью (к примеру, сульфатом натрия) до получения влажной порошкообразной массы, которая затем экстрагируется.
В качестве второго типичного примера связывания аналитов с компонентами матрицы можно привести ЖЖЭ из грунтовых вод любых неполярных соединений (например, полиароматических углеводородов, ПАУ). Грунтовые воды нередко содержат растворенные природные полимеры, которые в данном случае являются компонентами матрицы. Они хорошо адсорбируют из водного образца неполярные целевые соединения просто по причине низкой растворимости последних в воде. В этом случае для разрушения комплекса между аналитами и компонентом матрицы достаточно любым способом увеличить растворимость неполярных аналитов в водной среде. Этого достигают добавкой в водный образец небольшой, порядка 5-10 процентов, доли полярного органического растворителя, или же (реже) добавкой ионного ПАВ.

Преимущества ЖЖЭ:

а. Простота метода: простота его реализации, выбора условий экстракции, доступность реагентов.
б. «Всеядность» метода: жидкий образец не обязательно должен быть идеально гомогенным; в ряде случаев можно проэкстрагировать и эмульсию. Не допустимо лишь наличие осадка в образце (его необходимо предварительно отделить и экстрагировать далее отдельно).
в. Для больших объемов образца скорость проведения ЖЖЭ выше, чем ТФЭ (твердофазной экстракции, см. далее).

Недостатки ЖЖЭ:

а. Жидкость-жидкостная экстракция может оказаться достаточно трудоемкой, а иногда достаточно длительной и ресурсоемкой процедурой. Многое зависит от специфики конкретной ситуации и выбранной техники ЖЖЭ.
б. Проведение ЖЖЭ нередко осложнаяется образованием геля на границе между слоями, в результате чего слои бывает весьма проблематично отделить друг от друга. Более того, в подобных случаях извлечение целевых соединений, как правило, оказывается невысоким. Существует ряд способов разрушения коагуляционных структур (см. гл. «Способы разрушения эмульсий и коагуляционных структур»).
в. Применение ЖЖЭ принципиально не позволяет добиться полного извлечения целевых соединений, поскольку это равновесный метод. Более того, коэффициент распределения может весьма сильно зависеть от типа и концентрации компонентов матрицы в экстрагируемом образце. Образование коагуляционных структур может приводить к еще большей невоспроизвдимости степеней извлечения.

1.3.3. Традиционные техники ЖЖЭ. Жидкость-жидкостная микроэкстракция. Жидкофазная микроэкстракция

Все основные техники ЖЖЭ очень схожи между собой, и по сути различаются лишь по вовлекаемыми в экстракцию объемами – как образца, так и экстрагента. Уникальной техникой является лишь жидкофазная микроэкстракция с применением полой нити (LPME-HF).
Выделяют, как правило, традиционные и «микро» техники; однако, единого мнения по поводу того какую технику к какой категории относить не существует. Нередко все варианты реализации ЖЖЭ, когда используются небольшие объемы экстрагента, называют жидкость-жидкостной микроэкстракцией и даже жидкофазной микроэкстракцей, что вобщем-то по смыслу не вполне корректно.
Договоримся называть жидкость-жидкостной микроэкстракцией все техники, где объем образца не превышает 10-20 мл, а объем экстрагента не превышает 1-3 мл. Таким образом, экстракция двумя миллилитрами из 100 мл образца будет уже считаться традиционной техникой. Жидкофазной микроэкстракцей будем называть только жидкофазную микроэкстракцию с применением полой нити.
С учетом такой класификации можно сделать вывод, что традиционные, то есть наиболее трудоемкие и ресурсоемкие, методы ЖЖЭ все еще являются доминирующими.
Основной техникой продолжает оставаться экстракция в делительной воронке. Как правило, она осуществляется вручную, поскольку простые автоматы для перемешивания (т.н. «качалки») не могут обеспечить интенсивного встряхивания, которое как раз необходимо для быстрого установления адсорбционного равновесия.
Еще одно неудобство экстракции в делительной воронке проявляется при разделении слоев. В органический слой всегда попадает небольшая часть водного слоя, что в любом случае приводит к необходимости дополнительно осушать органический экстракт. Кроме того, проскакивающая часть водного слоя является «небольшой» только относительно объемов экстрагента порядка десятков миллилитров, а для объемов в несколько миллилитров она уже недопустимо «большая». Поэтому при проведении экстракции в делительной воронке используют достаточно большие объемы экстрагента, по крайней мере, более десятка миллилитров.
Положительный момент применения делительной воронки заключается в возможности выделить органический слой даже при образовании геля. Очевидно, аликвоту в этом случае отобрать невозможно, и единственный выход заключается как раз в выделении всего органического слоя вместе с гелем.
Существует достаточно распространенное заблуждение, что экстракция в делительной воронке является не слишком затратной процедурой из-за относительной дешевизны посуды и растворителей. В аналитике это утверждение совершенно не соответствует действительности; хорошие делительные воронки из пирекса с тефлоновыми затворами весьма дороги, как и высокочистые растворители, которых для традиционной ЖЖЭ требуется немало.
Если водные образцы достаточно чистые, и вероятность образования геля невысока, значительно более удобным вариантом является ЖЖЭ в спецальной экстракционной колбе, которая имеет отвод с узким горлом. Экстракцию проводят вручную, из большого объема водного образца, но объем экстрагента не превышает 5 мл. После проведения экстракции водного образца органический слой (он должен быть легче воды) вытесняют в узкую часть экстрактора путем добавления дистиллированной воды. После этого из органического слоя отбирают аликвоту. При образовании небольшого количества геля (пены, эмульсии) перед отбором аликвоты к экстракту добавляют несколько десятков микролитров полярного органического растворителя, например, этанола.
Трудоемкость этой техники ЖЖЭ можно значительно сократить, заменив ручное встряхивание перемещиванием при помощи достаточно мощной мешалки (т.н. «вортекс»). Экстракция происходит в бутыли со шлифом; после экстракции на шлиф одевают насадку с узким горлом, и далее процесс отбора аликвоты органического слоя повторяется.
При уменьшении объема экстрагируемого образца до 10-20 мл и ниже у метода ЖЖЭ появляется большой потенциал как в плане сокращения ресурсоемкости и повышения производительности процедуры, так и в плане увеличения ее гибкости. Особенно быстро при сокращении экстрагируемых объемов возрастает производительность экстракции.
ЖЖЭ образцов небольшого объема, как правило, проводят в пробниках различной вместимости (т.н. «виалах»). Пробники обязательно должны герметично завинчиваться крышкой с резьбой, выдерживающей существенное давление изнутри. Экстракция проводится при помощи т.н. «шейкера» – перемешивающего устройства с платформой, совершающей быстрые вертикальные колебания и медленные круговые движения; на платформу, как правило, устанавливают сразу несколько пробников. Процесс эстракции длится не более 1-2 минут. После экстракции пробники помещаются в холодильную камеру для снижения давления паров экстрагента; можно сразу же провести «вымораживание» образцов для разрушения возможной дисперсной фазы. После оттаивания образцы, как правило, в тех же пробниках, центрифугируют, что способствует лучшему разделению слоев (см. гл. «Способы разрушения эмульсий и коагуляционных структур»). Далее из пробника отбирают аликвоту органического экстракта.
Существует очень много вариантов и модификаций подобного рода техник микроэкстракции. Так, объем экстрагента может быть уменьшен до капли, то есть порядка 5-50 мкл. Если проводить экстракцию из 5-10мл образца, то степень концентрирования может оказаться даже выше, чем в традиционном варианте ЖЖЭ.
Существуют, конечно, некоторые трудности с выделением капли органического слоя, но они решаемы. Одим из возможных путей является замораживание капли и ее выделение в твердом виде. Для этого необходимо подобрать органический растворитель с температурой плавления в диапазоне от 0°С до 20-30°С (наиболее распространенным растворителем такого рода является бензол с температурой плавления +4°С).
Если экстрагент тяжелее водного образца, каплю экстрагента в смеси с некоторым количеством полярного растворителя-диспергатора (лучшие результаты показывает ТГФ) можно напрямую диспергировать в объеме образца. После разделения слоев (можно ускорить этот процесс центрифугированием) аликвота отбирается со дна пробника; соответствено, в этом случае необходимо брать пробник с коническим дном.
Уникальным вариантом реализации ЖЖЭ является жидкофазная микроэкстракция (с полой нитью), LPME-HF. Основным расходным материалом является полимерный пористый капилляр; до экстракции его в течение некоторого времени выдерживают в полярном органическом растворителе, не смешивающемся с водой (как правило, н-октаноле или дигексиловом эфире). В более простом двухфазном варианте капилляр заполняется тем же органическим растворителем. Затем капилляр герметично закупоривают в опускают в водный образец; экстракция происходит при перемешивании образца при помощи магнитной мещалки. Готовый экстракт объемом несколько микролитров переносят в аналитический шприц и, как правило, сразу вводят в хроматограф. Описанный двухфазный вариант подходит для экстракции неполярных соединений из водных образцов.
Наибольший интерес, однако, вызывает трехфазный вариант жидкофазной микроэкстракции, когда экстрагентом является водный раствор кислоты (для извлечения основных органических соединений) или водный раствор щелочи (для извлечения кислых органических соединений).
К примеру, для экстракции органической кислоты водный образец необходимо довести сильной кислотой до рН порядка 2; водный экстрагент, напротив, довести щелочью до рН 10-12. Органическая кислота в более гидрофобной молекулярной форме вначале проэкстрагируется фазой н-октанола в полимерном капилляре, а затем в виде ионной формы растворится в экстрагенте.
Метод трехфазной жидкофазной микроэкстракции идеален для извлечения из водных образцов органических кислот и оснований, если их молекулы достаточно гидрофобны и невелики. Для крайне полярных соединений, и/или соединений с крупной молекулой, этот метод не дает хороших результатов. С другой стороны, жидкофазную микроэкстракцию можно целенаправленно применять для извлечения ионных органических веществ из водных матриц, насыщенных полимерными веществами – а к ним относятся большинство биологических и экологических образцов.

1.2.4. Концентрирование пробы отгонкой растворителя: техники, ограничения. Замена растворителя

Широко распространенными техниками концентрирования экстрактов путем отгонки растворителя являются упаривание в ротационном испарителе и отгонка в токе азота.
Ротационный испаритель применяют в том случае, когда исходный объем экстракта достаточно велик, ориентировочно более 10 мл. Как правило, экстракт не упаривают досуха, а оставляют небольшой объем 0.5-5 мл. Растворитель удаляется под вакуумом при равномерном нагреве в водной бане.
Если определение проводят с применением стандартов-суррогатов, то в колбе оставляют, как правило, небольшой объем экстракта порядка 0.5 мл. При помощи шприца в него вносят стандарт выхода, а затем переносят экстракт из колбы непосредственно в виалу для готовой пробы. Пол-миллилитра экстракта можно без затруднений перенести в виалу на 1 мл даже из колб объема 100-200 мл – все дело в тренировке.
По-другому поступают, если определение проводят без применения стандартов-суррогатов, то есть методом внешнего стандарта, или же внутреннего стандарта, когда стандарт добавляют непосредственно перед вводом пробы в хроматограф. В этом случае потери при переносе экстракта из колбы недопустимы, поэтому оставляют по крайней мере несколько миллилитров упаренного экстракта, которые по возможности количественно пеерносят в пробник (колбу можно промыть небольшим количеством растворителя и добавить смыв к экстракту). Из пробника остаток растворителя удаляют в токе азота.
Отгонка растворителя в токе азота – это очень распространенная техника. Объем исходного экстракта, как правило, не превышает 10 мл, а конечный объем упаренного экстракта составляет порядка 0.2-0.5мл. В процессе отгонки пробник нередко аккуратно нагревают до 50-60°С для ускорения испарения.
Кроме того, существуют автоматизированные системы упаривания экстрактов различной конструкции. Они применяются при большом потоке анализов с однотипной схемой пробоподготовки, включающей отгонку растворителя. Подобными системами могут комплектоваться и комплексные автоматизированные системы подготовки пробы (например, см. гл. «Автоматизированные системы экстракции под давлением»).
У подхода к концентрированию пробы путем отгонки растворителя есть ряд ограничений. Так, его применение становится проблематичным, если целевые соединения обладают высокой летучестью – отгонка растворителя в этом случае гарантировано приводит к их частичной или полной потере. Если целевые соединения обладают умеренной летучестью, потери можно свети к минимуму, если:
а. применять для экстрагирования высоколетучие растворители (дихлорметан, диэтиловый эфир, в меньшей степени гексан, ацетон);
б. работать в экстрактом аккуратно, отгоняя растворитель в слабом токе азота, желательно, без нагревания (вакуум противопоказан категорически);
в. не упаривать экстракт до совсем малых объемов, то есть оставлять 0.5-1 мл экстракта.
Попытка значительно сконцентрировать экстракт отгонкой растворителя может закончиться неудачно, если экстракт является слишком «грязным» (включает большое количество компонентов матрицы) или плохо осушен (содержит значительную долю влаги). По этой причине процедуры осушения и очистки экстракта всегда предшествуют отгонке растворителя.
Если объем экстракта, подлежащего очистке, значителен, то отгонку растворителя проводят в два этапа. Сначала проводят осушение и предварительную отгонку растворителя (например, при помощи ротационного испарителя) до объема порядка 10-20 мл (работать с таким объмом уже достаточно удобно). После стадии очистки еще раз отгоняют растворитель, и уже в этом случае доводят объем до разумно минимального, то есть 0.2-0.5 мл.
Отгонка растворителя является одним из подходов, применяемых для его замены. В случае нелетучих и стабильных целевых соединений можно менять растворитель «через сухой остаток»; при этом исходный растворитель сначала полностью удаляется, а сухой остаток перерастворяется в другом растворителе. Другой вариант состоит в том, чтобы упарить экстракт до небольшого объема, а затем разбавить его другим растворителем.