Глава 1.6. Обеспечение штатной работы хроматографа

[Константин Сычев]

1.6.1. Рабочее место. Расположение хроматографа

Помещение, где устанавливается жидкостной хроматограф, должно быть отапливаемым и кондиционируемым. Прибор должен располагаться как можно дальше от отопительных приборов, радиаторов, кондиционеров, а также источников сквозняка: форточек, открытых дверей и проемов, включенных тяг. Особенно чувствительно реагируют на небольшие изменения температуры жидкостные хроматографы без термостата.
Качество электропитания для хроматографа и подключенного к нему ПК должно быть на высоком уровне. Электрические наводки в сети являются одной из возможных причин повышенного шума детектора. Подключать все блоки к сети рекомендуется через источник бесперебойного питания, который сглаживает резкие скачки напряжения, а также обеспечивает работу прибора в течение десяти-пятнадцати минут до завершения анализа при отключении энергии. Нежелательно использовать в сочетании с АЦП и/или детектором любые устройства, подключаемые к электрической сети через адаптер, выпрямитель и т.д., например, ноутбуки (можно применять ноутбук в режиме работы от аккумуляторов).
Для установки пробора и ПК вполне достаточно обычного лабораторного стола с покрытием, устойчивым к действию органических растворителей и кислот. Стол должен быть достаточно тяжелым и устойчивым, чтобы обеспечивать отсутствие вибраций прибора. Весь прибор, включая ПК, желательно устанавливать на одном столе подходящей длины (хороший стандарт – 1600х600 мм), без тумб. Смысл заключается в том, чтобы под столом не было никаких перегородок или предметов, затрудняющих перемещения оператора вблизи прибора.
На рабочем столе должно оставаться некоторое рабочее пространство порядка 500 мм по длине; его можно обеспечить за счет второго стола такой же высоты. Некоторое пространство шириной не менее 100-200 мм должно оставаться и перед прибором. Тумбы, шкафы и стеллажи с дополнительными устройствами, инструментами и расходными материалами можно расположить рядом с прибором.
Стул для оператора прибора должен быть офисным: мобильным (на колесиках), легким и с невысокой спинкой, с регулируемой высотой. Высота должна быть отрегулирована так, чтобы оператор мог работать с ПК и инжектором (ручным или автосамплером), не вставая со стула.
В относительном расположении блоков прибора также желательно придерживаться определенной логики. Насосную систему желательно устанавливать дальше от ПК, чтобы избежать попадания растворителей на ПК и на рабочий журнал. Ручной инжектор или автосамплер следует устанавливать так, чтобы оператор мог работать с ними, сидя на стуле.
Насосную систему и резервуар с растворителями необходимо устанавливать так, чтобы с ними было удобно работать стоя. Часто насосы, тем не менее, ставят на стол (т.е. внизу), мотивируя это тем, что брызги растворителя при таком расположении не могут навредить блокам прибора, расположенным под насосом. Мотив этот верный, однако решение неправильное. Насосы желательно ставить на специальную подставку; резервуар(ы) с растворителями лучше ставить не на насосную систему (как часто показано на рекламных проспектах), а сбоку от нее, например, на ту же подставку. При этом высота подставки подбирается так, чтобы и с насосной системой, и с резервуарами было удобно работать стоя.

1.6.2. Приготовление элюента. Заполнение насосной системы элюентом. Замена элюента

Каждый компонент элюента необходимо отмерять раздельно, не смешивая элюент прямо в мерном цилиндре. Для каждого компонента желательно использовать свой цилиндр. Объем цилиндра следует подбирать исходя из отмеряемого объема растворителя, так, чтобы точность дозирования растворителя была максимальна.
Если элюент на водной основе содержит неорганическую соль или соль ион-парной добавки, то после приготовления элюент необходимо профильтровать через мембранный фильтр. Фильтрация элюента осуществляется под небольшим вакуумом при помощи специального фильтра на основе колбы Бунзена. Одноразовую фильтрующую мембрану кладут на пористое стеклянное основание фильтра, с помощью зажима закрепляют на фильтре стакан для элюента. Включают вакуумный насос и проводят фильтрацию; элюент, очищенный от механических примесей, собирается в приемной колбе. Этот способ позволяет проводить одновременное дегазирование элюента.
Элюенты на водной основе необходимо дегазировать, то есть удалять из него растворенный воздух. Если насосная система не имеет автоматического дегазатора, то дегазировать элюент следует в обязательном порядке; при наличии автоматического дегазатора дегазация элюента все же желательна. Самый простой способ одновременного дегазирования и фильтрации состоит в пропускании элюента через специальный фильтр элюента под вакуумом (см. выше).
Элюенты, обогащенные водной компонентой, можно дегазировать нагреванием. Для этого плоскодонную колбу с элюентом с приоткрытой пробкой ставят в водную баню при температуре около 50-60 градусов на 10 минут. Затем пробку закрывают, а колбу охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры.
Порядок заполнения "сухой" насосной системы элюентом зависит от предыстории ее применения. Если она не известна, или жидкостная система оставалась незаполненной в течение длительного времени, то в начале насосы следует заполнить и промыть водой.
Порядок действий примерно таков. В линию А поставьте емкость с дегазированной водой. Отсоедините колонку от инжектора, а сам капилляр от инжектора направьте в пустую емкость. Через открытый сливной клапан насоса или иной его выход (зависит от системы), пользуясь специальным шприцем для промывки насосной системы или обычным медицинским шприцем на 25 мл с соответствующей насадкой, аккуратно потяните шток шприца на себя – вода заполнит всю жидкостную систему насоса и начнет набираться в шприц. Аккуратно отсоедините промывной шприц, закройте клапан на слив (или проделайте аналогичную операцию, чтобы соединить насос и инжектор). Включите насос, поставив скорость подачи порядка 5 мл/мин – вода будет поступать в сливную емкость из инжектора. Промывайте систему водой в течение 5-10 минут. Проследите, чтобы в жидкостной линии не было крупных пузырей воздуха. Если они появляются, следуйте инструкциям, описанным в главе 1.7.
В принципе, в течение промывки инжектор можно соединить при помощи капилляра и муфты напрямую к детектору. В этом случае водой также промоется и кювета детектора.
После промывки системы водой повторите ту же процедуру, но используя элюент вместо воды (напомню, что это касается только элюентов на водной основе!) Далее установите приемлемую скорость потока, установите хроматографическую колонку и прокондиционируйте ее.

Предварительную промывку жидкостной системы водой можно рекомендовать даже для заполненных элюентом систем, если они заполнены водными элюентами с добавками солей, или если новый элюент содержит соли. Если система заполнена водным элюентом без добавок, и новый элюент на водной основе также не содержит добавок, то предварительная промывка водой не требуется – систему сразу можно заполнять новым элюентом.
В том случае, когда система заполнена элюентом на основе гексана или иного слабополярного органического растворителя, и новый элюент также принадлежит такому типу, никаких предварительных промывок также не требуется.
Особого внимания заслуживают случаи перехода к водного элюента на неводный и наоборот. В случае перехода к водного элюента на неводный жидкостную систему сначала необходимо промыть водой. Затем подобным образом систему необходимо промыть либо ацетоном, либо изопропанолом (оба растворителя неограниченно смешиваются и с водой, и с гексаном). Чаще применяют изопропанол. Промывать в обоих случаях следует и насосы, и кювету детектора. При промывке изопропанолом скорость подачи устанавливают менее 5 мл/мин – к примеру, 2-3 мл/мин. И только затем систему заполняют неводным элюентом.
Последовательность действий при переходе с неводного элюента к водному строго обратна приведенной выше: систему сначала промывают изопропанолом, затем водой, затем заполняют ее элюентом.


1.6.3. Фильтрация пробы. Применение ин-лайн фильтров и предколонок

При проведении потоковых определений перед основной колонкой можно рекомендовать устанавливать предколонку. Предколонка (pre-column) – это очень короткая колонка, как правило, длиной 1см, которая служит для защиты основной колонки от сильно удерживаемых, загрязняющих колонку компонентов проб. Обычно предколонка помещается в разборный держатель, который при помощи капилляра или же напрямую соединяется с основной колонкой.
Возможная проблема при применении предколонок может заключаться в небольшой потере эффективности разделения; однако, качество исполнения соединений в настоящее время достаточно высоко, чтобы на аналитических колонках диаметра 4 и 4.6 эта потеря была практически незаметна.
Предколонку можно менять периодически, к примеру, раз в месяц. Это, тем не менее, не означает, что предколонки необходимо выбрасывать. До определенного момента их можно вполне успешно регенерировать. В примеру, обращенно-фазовые предколонки можно регенерировать смесью ацетонитрил-хлороформ 4:1, установив их в обратном направлении.
Кроме химических веществ, загрязняющих колонку, в пробе могут присутствовать и механические примеси. От крупной взвеси и осадка можно избавиться при помощи небольшой настольной центрифуги (они вполне дешевы и при этом практичны). Не рекомендуется фильтровать пробы через какие бы то ни было фильтры; во-первых, это достаточно трудоемко, во-вторых – очень сомнительно с точки зрения правильности количественного определения.
В пробе могут присутствовать и тонкие взвеси, то есть очень мелкие, порядка микрометров, механические примеси. Они не фильтруются через стандартные фильтры для проб, но удаляются при помощи центрифугирования. Характерный признак присутствующей в пробе нерастворимой взвеси – ее опалесценция (проба выглядит немного мутной, рассеивающей свет).
Метод борьбы со взвесью – либо центрифугирование проб, либо применение ин-лайн фильтров. Ин-лайн фильтр – это пористый титановый фильтр с диаметром пор порядка одного микрометра, который, подобно предколонке, устанавливается перед колонкой (или перед предколонкой) в специальном разборном держателе.

1.6.4. Профилактические работы

Для поддержания жидкостного хроматографа в рабочем состоянии периодически необходимо выполнять несложные профилактические работы.
Из повседневных операций можно отметить промывку ручного инжектора. В то время как автосамплеры содержат функцию автопромывки, ручные инжекторы должен промывать сам оператор. Для этого рядом с инжектором устанавливают две высоких пробирки с завинчивающимися крышками и в каждую из них переносят достаточный объем чистого элюента. Одна пробирка служит для промывки шприца, другая – для промывки инжектора. Инжектор промывают чистым (предварительно промытым или вообще отдельным) шприцем, инжектируя в положении крана "load" несколько полных его объемов. В качестве промывочного можно использовать и небольшой медицинский шприц (пластиковый только в случае водных элюентов!) с насадочной затупленной иглой. Если время позволяет, после промывки инжектора можно провести холостой анализ, чтобы убедиться в полноте его очистки.
При работе с экстремально кислыми (рН < 2) и содержащими соли элюентами в конце для необходимо промывать всю жидкостную систему, включая колонку. Если работа идет в обращенно-фазовом режиме, то для промывки можно использовать смесь вода-ацетонитрил 9:1.
При работе со 100%-водными подвижными фазами в обращенно-фазовом режиме во избежание фазового коллапса колонки в конце дня всю систему, включая колонку, необходимо промывать водой, а затем заполнять колонку чистым органическим растворителем, например. ацетонитрилом.
Раз в неделю можно устраивать генеральную уборку колонке, чтобы в ней не накапливались загрязняющие вещества, которые затем могут проявляться на хроматограммах в виде горбов и дрейфа базовой линии. К примеру, обращенную фазу можно промывать чистым органическим растворителем (например, ацетонитрилом) в обратном направлении, установив небольшую скорость потока (например, в несколько раз меньше рабочей).
Раз в месяц необходимо мыть резервуары для подвижной фазы. С такой же периодичностью необходимо проверять чистоту шприца; при необходимости промывать его или менять на новый. Предколонку (если таковая применяется) также можно менять раз в месяц.
Периодически раз в полгода-год необходимо проводить комплексную проверку хроматографа и обновление его сменных частей. В аккредитованных лабораториях, например, это необходимо в обязательном порядке делать перед поверкой хроматографа.
Если финансирование позволяет, то перед проверкой желательно сразу произвести замену:
- отборных линий вместе со входными фильтрами элюента;
- источников излучения (ламп);
- колонок, на которых ведется основная часть работы.
Если такой подход полагается слишком затратным, то работоспособность каждой из приведенных частей необходимо отдельно проверять (см. далее).
Раз в год бывает полезно проводить чистку клапанов насоса, даже если внешне работа насоса не вызывает нареканий. Эту процедуру, к сожалению, не смогут проводить пользователи систем закрытого типа, для которых разборка насоса вообще не предусмотрена производителем (разбирать насос могут только сервис-инженеры). Начинающим пользователям можно порекомендовать учиться сборке-разборке насоса под контролем сервис-инженера поставщика: это будет выгодно обеим сторонам.
Демонтированные клапаны (в сборе, т.е. разбирать их не надо) помещают в ультразвуковую ванну, в водный раствор азотной кислоты и любого моющего поверхностно-активного вещества. Проводят обработку ультразвуком в течение времени от часа до нескольких часов, часто при небольшом нагревании. Затем несколько раз промывают клапаны в ультразвуковой ванне водой. Вместе с клапанами заодним можно почистить входные фильтры для элюентов (если принято решение оставить старые фильтры).
Начать проверку можно с насосной системы. Приготовьте и продегазируйте элюент, затем аккуратно заполните элюентом насосную систему, внимательно следя за тем, чтобы в жидкостной системе не было микропузырьков воздуха. При помощи мерного цилиндра и секундомера сравните соответствие реальной объемной скорости потока заданному значению.
Проведите этот эксперимент на нескольких скоростях, а также как без колонки, так и с установленной типовой колонкой (то есть под давлением). Если эксперимент показывает значительное, порядка 10% и более, отклонение реальной скорости потока от заданной – это повод вплотную заняться жидкостной системой прибора. Первым делом необходимо почистить (или заменить на новые) клапаны насосов и входные фильтры элюента, заменить трубки отбора элюента на новые. Если эти действия не приносят успеха, то можно либо попытаться промыть поршни и заменить целиком головки насоса (если есть запасные головки), либо надо сразу обращаться в сервисную службу.
Всю систему в сборе желательно проверить на отсутствие течей из-под нижних клапанов насосов и из выводов инжектора при значительном давлении порядка 300 атм. Течь из-под нижнего клапана насоса на давлении порядка 300 атм при ее отсутствие на давлении 100 атм свидетельствует о том, что пора либо заменить заборную линию элюента на новую (износилось уплотнение линии), либо почистить клапаны насоса и промыть всю насосную систему (шарик нижнего клапана не попадает точно в седло). Течь из инжектора на давлении порядка 300 атм при ее отсутствие на давлении 100 атм (то есть причина не в соединениях) свидетельствует о том, что, возможно, следует задуматься о замене инжекторного крана на новый. Вообще, замену инжекторного крана проводят раз в два-три года, в зависимости от интенсивности работы.
После этого проверку хроматографа проводят уже с установленной колонкой и со включенным детектором. Здесь будем полагать, что тестируется система с УФ детектором. Длину волны можно установить равной 210 нм. Колонку кондиционируют до получения ровной базовой линии. До этого колонку можно специально промыть. Ни в коем случае нельзя брать для теста новую колонку или "просохшую" колонку, на которой долго не работали. Лучше взять колонку, на которой работали недавно.
Далее необходимо удостовериться, что насосная система работает штатно: шум базовой линии должен быть "белым", т.е. не должно быть периодических низкочастотных шумов. Если на базовой есть некоторые низкочастотные всплески, периодичность появления которых не совпадает с периодом движения плунжера насоса, то нельзя исключить наличие наводок в электрической сети или загрязнение кюветы детектора.
Готовят раствор тестового вещества, например, кофеина (в этом случае при применении С18 неподвижной фазы элюент ацетонитрил-вода должен содержать порядка 20% ацетонитрила). Проводят одно-два инжектирования; измеряют амплитуду белого шума и высоту сигнала. Отключают детектор от сети и отсоединяют от жидкостной системы; проводят замену лампы на новую. Подсоединяют и включают детектор; повторяют одно-два инжектирования. Проводят еще одно измерение амплитуды белого шума и высоты сигнала; характеристики, полученные на новой лампе, сравнивают с соответствующими характеристиками, полученными на старой лампе. Если старая лампа значительно проигрывает новой, то старую лампу следует заменить. Формально УФ лампа может служить от 1000 до 2000 часов с сохранением своих оптимальных характеристик.