Базовой линией (baseline) называется линия фонового сигнала детектора. Она прямая, если из колонки не элюируются вещества и/или если данный детектор принципиально не может на них реагировать.
На практике фоновый сигнал детектора не выглядит как абсолютно гладкая линия. Как и любой сигнал от электронного устройства, он имеет шумы. Шум, по сути, можно определить как отклонение показаний детектора в одну и другую сторону от средневзвешенной базовой линии. Если промежуток времени выбрать сравнительно небольшим, к примеру, порядка секунд, мы будем наблюдать высокочастотные шумы.
Если задать промежуток времени равным нескольким секундам или более, то будет наблюдаться сумма высокочастотных и низкочастотных шумов. Вообще, при работе прибора в штатном режиме низкочастотных шумов быть не должно; низкочастотные шумы свидетельствуют о каких-либо погрешностях в работе прибора. Поэтому сначала рассмотрим "нормальные" высокочастотные шумы, источники их возникновения и способы борьбы с высокочастотными шумами.
Частота высокочастотного шума определяется количеством точек на хроматограмме, получаемых в единицу времени, которое, в свою очередь, задается одним из двух параметров: либо постоянной времени (параметр детектора), либо частотой сбора данных (параметр аналого-цифрового преобразователя, АЦП). Частота сбора данных (frequency) – это частота, с которой АЦП считывает показания детектора. Постоянная времени (time constant, TC) – это время, в течение которого детектор накапливает сигнал, который затем "передается" АЦП. Если оператор имеет возможность изменять оба параметра, то частоту, как правило, выставляют соответствующей постоянной времени, например, частоту 10 Гц при постоянной времени 0.1 с (10 точек в секунду), или 5 Гц при постоянной времени 0.2 с (5 точек в секунду).
Увеличение постоянной времени приводит к уменьшению амплитуды высокочастотного шума за счет некоторого усреднения сигнала детектора, а частота сбора данных никак не влияет на амплитуду шума. Поэтому можно устанавливать частоту сбора данных большей, чем необходимо исходя из заданной постоянной времени (к примеру, 10 Гц при постоянной времени более 0.1 с) – это не приведет к увеличению амплитуды шума.
Может возникнуть вопрос: почему бы сразу не установить на детекторе такое достаточно высокое значение постоянной времени, чтобы предельно уменьшить амплитуду высокочастотного шума? В принципе, довольно часто так и поступают, то есть устанавливают постоянную времени вручную в диапазоне порядка от 0.5 до 2 секунд при частоте приема данных АЦП равной 2-0.5 Гц. Такой вариант вполне приемлем, если время элюирования целевого соединения составляет не менее 15 секунд. В этом случае при частоте 1 Гц и постоянной времени 1 с каждый пик будет описываться по крайней мере 15-тью точками, что вполне приемлемо для нормальной повторяемости площади пика и иных его параметров.
Но элюирование за 15 секунд – это, надо признать, не очень быстро; общая продолжительность хроматограммы в этом случае вряд ли составляет менее 15 минут. Современная же тенденция ВЭЖХ как состоит в сокращении времени анализа до нескольких минут и менее. В этом случае время элюирования наименее удерживаемых компонентов составляет порядка 1-2 секунд и менее, и для адекватного задания формы пика необходимым числом точек количество точек в секунду на хроматограмме должно быть не менее 10-ти.
Значение 10 точек как раз является пределом для традиционных АЦП с максимальной частотой 10 Гц и традиционных детекторов с минимальной постоянной времени 0.1 с. На значительно более высокие скорости считывания рассчитаны современные специализированные системы быстрой хроматографии с частотой АЦП порядка 100 Гц, позволяющие регистрировать пики, ширина которых составляет доли секунды.
Источниками высокочастотных шумов могут являться: электроника прибора, детектирующий элемент, источник света (лампа), кювета детектора. Если прибор полностью исправен и оптимально настроен, то амплитуда шума детектора должна быть не более "паспортного" значения, указанного в описании типа средства измерения (СИ).
Если наблюдаемый шум в режиме остановленного потока явно превосходит норму, то до того как обращаться в сервисную службу, следует проверить несколько типичных источников повышенного шума. Во-первых, следует удостовериться, что кювета детектора заполнена тщательно дегазированным элюентом, желательно, чистым органическим растворителем. Микропузырьки воздуха – частая причина повышенного шума. Для подавления образования микропузырьков в кювете необходимо дегазировать элюенты и/или применять ин-лайн дегазаторы и/или установить противодавление на конце сливного капилляра.
Во-вторых, шум может быть обусловлен нестабильной работой лампы, если ее ресурс полностью выработан. В этом случае лампу надо заменить на новую. Ресурс УФ лампы, к примеру, составляет порядка 2000 часов.
В-третьих, высокочастотный шум может увеличиться по причине каких-либо наводок электрической сети, особенно если прибор не заземлен. И порой от мощных наводок бывает сложно защититься даже при помощи сетевого фильтра. Как пример приведу казусный случай, когда от общей сети был запитан лифт, в результате чего прибор мог нормально работать только по ночам. Второй частный случай: если программа обработки данных установлена на ноутбуке, то шум может значительно увеличиваться при включении ноутбука в сеть; то есть надо переходить на работу от аккумулятора, что далеко не всегда удобно (см. также гл. 1.7.4).
Но допустим, что уровень высокочастотных шумов в целом укладывается в норму. Можно ли еще уменьшить их амплитуду? В принципе, можно, но не сильно: в два, три раза – но не на порядок. Во-первых, как мы уже выяснили, при использовании оптического детектора можно увеличить постоянную времени, а частоту АЦП, соответственно, уменьшить. Но это действие приведет к уменьшению количества точек на хроматограмме в единицу времени, что может быть неприемлемо для "быстрой" хроматографии.
Такого же результата можно добиться, получая хроматограмму при минимальном значении постоянной времени и максимальной частоте, а затем применяя процедуру сжатия хроматограммы – если установленное ПО позволяется это осуществить. Смысл процедуры состоит в следующем. Сначала получают хроматограмму на максимальной скорости работы АЦП (например, при частоте 10 Гц для традиционных АЦП). Далее оператор производит предварительную разметку пика наименее удерживаемого целевого компонента (ширина такого пика на хроматограмме минимальна) и задает количество точек, которым должен описываться самый узкий пик (как правило, не менее 10-ти точек на пик). Затем программа производит усреднение результатов для всей хроматограммы, «выбрасывая» из нее лишние точки (см. рис. 71).
После сжатия уровень шума можно еще немного снизить путем применения различных фильтров шумов. Эта процедура называется сглаживанием хроматограммы. Вообще, популярность этого способа уменьшения шума невысока, вероятно, из-за того, что он, по сути, искусственный, исключительно математический.
Некоторые ПО позволяют выбирать между различными типами фильтров. В любом случае, какой бы фильтр не использовался, необходимо помнить, что чрезмерное сглаживание в определенный момент приводит к заметному искажению параметров пика: увеличению ширины, появлению «провала» у основания и т.д. При использовании процедуры сглаживания необходимо руководствоваться здравым смыслом и не допускать искажения градуировки или уменьшения повторяемости из-за недопустимо большого числа циклов сглаживания.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Снижение уровня шума при сжатии хроматограммы. (а) 160 точек в пике, (б) 20 точек в пике, (в) 10 точек в пике. www.chromforum.ru
Рисунок 71. Снижение уровня шума при сжатии хроматограммы. (а) 160 точек в пике, (б) 20 точек в пике, (в) 10 точек в пике
Амплитуда шума определяется как разница между его верхней и нижней границами. Отношение высоты пика к амплитуде шума называется отношением сигнал/шум. Здесь оно будет обозначаться как SN (вместо общепринятого S/N, поскольку косая дробь в обозначении может внести путаницу в формулы). Высота пика, иначе величина сигнала, определяется как расстояние от базовой линии (то есть середины диапазона шума) до верхнего значения в максимуме пика.
Отношение сигнал/шум является важной характеристикой пика, которая влияет на точность определения его площади. В конечном итоге, для пиков с невысоким SN отношение сигнал/шум в основном определяет точность количественного определения соответствующего компонента (строго говоря – это утверждение верно при отсутствии наложения других пиков).
Считают, что условием надежного обнаружения вещества является трехкратное превышение полезным сигналом амплитуды шума. Концентрацию компонента в пробе, при которой в выбранных условиях для пика данного компонента достигается SN = 3, называют пределом обнаружения (limit of detection, LOD) этого компонента.
Условием адекватного количественного определения является десятикратное превышение амплитуды шума сигналом от компонента, SN ≥ 10. Концентрация компонента в пробе, при которой в выбранных условиях достигается SN = 10, называют пределом определения (lowest limit of detection, LLOQ) этого компонента.
Необходимо помнить, что пределы обнаружения и определения, в зависимости от методики определения, могут быть характеристиками как отдельно взятого детектора, так и всей хроматографической системы, или даже всей аналитической методики. Не надо их путать!
Кроме высокочастотных шумов, на хроматограмме можно наблюдать низкочастотные шумы с характеристическим временем от секунд до десятков секунд. Нередко они имеют явно выраженный периодический характер.
Как мы уже выяснили, наличие таких шумов свидетельствует о том, что в работе хроматографа есть какие-то погрешности. Чаще всего причиной появления низкочастотных шумов является нестабильная работа насосной системы, которая, в свою очередь, в большинстве случаев объясняется несоблюдением простейших правил эксплуатации. При высокой амплитуде низкочастотного шума количественный анализ может стать очень затруднительным, а для слабых сигналов – попросту невозможным (см. рис. 72б).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пик (сигнал) с отношением сигнал/шум SN = 10 на фоне высокочастотного шума (а) и на фоне высокочастотного и низкочастотного периодического (б) шумов. www.chromforum.ru
Рисунок 72. Пик (сигнал) с отношением сигнал/шум SN = 10 на фоне высокочастотного шума (а) и на фоне высокочастотного и низкочастотного периодического (б) шумов
При появлении периодического шума как первое действие можно постараться промыть ее текущим элюентом на повышенной скорости около 5 мл/мин при открытом клапане на слив. Это процедура способствует удалению из жидкостной системы небольших пузырьков воздуха. Если элюент приготовлен на водной основе, то его необходимо повторно тщательно дегазировать и перезаполнить всю жидкостную систему прибора.
Если эти простые меры не помогают, то следующая вероятная причина может заключаться в засорении клапанов насоса. В этом случае клапаны следует демонтировать и промыть в течении часа водным раствором азотной кислоты в ультразвуковой ванне, можно с одновременным подогревом. К сожалению, насосы некоторых производителей имеют закрытый дизайн и не позволяют проводить самостоятельную сборку и разборку головки насоса.
При более серьезной проблеме, возможно, будет необходимо заменить клапаны, уплотнения и т.д., то есть полностью "перебрать" головку насоса. При глубоком износе, вероятно, будет легче полностью заменить головку насоса на новую.
Отклонение базовой линии от горизонтального хода называется дрейфом. Это явление однозначно нежелательное. Дрейф способен сильно затруднить количественный анализ. Чтобы понять почему, рассмотрим следующую ситуацию.
Допустим, дрейфа нет – на фоне абсолютно ровной, горизонтальной базовой линии детектор прописывает пик. Для количественного анализа необходимо определить его площадь (также говорят – проинтегрировать пик, или провести интегрирование). В свою очередь, для определения площади необходимо провести разметку пика: отметить его начало и конец – и тогда программа сама проведет между ними линию, которая называется основанием пика. Эта линия, по сути, является нашим предположением о ходе базовой линии в диапазоне времени выхода пика (см. рис. 73). Если дрейфа нет, то мы автоматически предполагаем, что и в момент выхода пика фоновый сигнал не изменяется: основание является просто продолжением базовой линии, то есть горизонтальным прямым отрезком (см. рис. 74а).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Вариант разметки пиков: 1, 3, 5 – начало пиков, 2, 4, 6 – концы пиков. www.chromforum.ru
- 73_1.jpg (13.66 Кб) Просмотров: 29012
Рисунок 73. Вариант разметки пиков: 1, 3, 5 – начало пиков, 2, 4, 6 – концы пиков
В этом случае не возникает никаких затруднений в определении начала и конца пика. Соответственно, и правильность определения площади пика оказывается максимальной – что, собственно, и требуется для правильного количественного анализа. В принципе, то же можно сказать о ситуации с умеренным равномерным линейным дрейфом (см. рис. 74в), только основание там уже является не горизонтальной, а наклонной прямой.
Теперь допустим, что пик начал прописываться при горизонтальной базовой линии на одном уровне, а закончил прописываться также при горизонтальной базовой, но уже на другом уровне (см. рис. 74б). Здесь мы имеем дело с довольно неприятным видом дрейфа: базовая линия «под пиком» выглядит как ступенька. Даже если провести холостой анализ и получить бланк хроматограммы (то есть мы непосредственно увидим ход базовой линии в данных условиях хроматографирования) – все равно это не поможет правильно разметить пик, и может не позволить определить его площадь с требуемой точностью. Причина заключается в том, что нам будет непонятно где именно установить конец пика, чтобы допустить минимальную погрешность интегрирования (см. рис. 74б). Также проблематичен и случай сильного линейного дрейфа: здесь уже могут появиться затруднения с определением и конца, и начала пика (см. рис. 74г). Бороться с этой проблемой каким-либо расчетным путем невозможно. Надо уменьшать дрейф, устраняя причину его появления.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пик (сигнал) с отношением сигнал/шум SN = 10 на фоне высокочастотного шума при отсутствии дрейфа базовой линии (а), при дрейфе «ступенью» (б), умеренном линейном (в) и сильном линейном дрейфе (г). www.chromforum.ru
Рисунок 74. Пик (сигнал) с отношением сигнал/шум SN = 10 на фоне высокочастотного шума при отсутствии дрейфа базовой линии (а), при дрейфе «ступенью» (б), умеренном линейном (в) и сильном линейном дрейфе (г)
Причины дрейфа, то есть изменения фонового сигнала детектора, могут быть различными. Одна из причин – изменение состава элюента при градиентном элюировании. Некоторые детекторы настолько к этому чувствительны, что совершенно непригодны для проведения любых градиентов (к примеру, рефрактометрический детектор). Спектрофотометрические детекторы в этом смысле вполне пригодны для проведения градиентного элюирования. При соблюдении требований к чистоте растворителей градиентное элюирование приводит к умеренному дрейфу. Для УФ детектора величина дрейфа зависит от длины волны: дрейф меньше для длинных и больше для коротких (< 230 нм) длин волн поглощения.
Дрейф может наблюдаться и в изократическом режиме, например, при использовании схемы рецикла элюента. Если в этом случае дрейф оказывается критичным для точного количественного анализа, от схемы рецикла следует отказаться.
Наблюдение "ступенчатого" дрейфа (рис. 74б) в изократическом режиме без рецикла свидетельствует о той или иной погрешности в разработанной методике разделения. Наиболее частый случай состоит в наложении целевого пика на значительно более широкий пик, элюирующийся с предыдущего анализа (или анализов). В такой ситуации существует по крайней мере два решения проблемы. К примеру, в программу элюирования в конце можно ввести стадии промывки и кондиционирования, если в состав хроматографа входит градиентная насосная система. Если насосная система изократическая, то следует просто увеличить общее время анализа, чтобы все нецелевые, но существенные по уровню сигнала компоненты пробы успели элюироваться с колонки до начала нового анализа.
Еще одна причина может заключаться в деградации целевого соединения в процессе хроматографирования. На это может указывать воспроизводимость общей картины со "ступенчатым" дрейфом при постепенном уменьшении площади пика со временем. В этом случае пик продукта деградации надо искать в направлении с более высоким уровнем базовой линии. Здесь дрейф является лишь отражением более серьезной проблемы – с устойчивостью целевого соединения.
1.4.2. Разметка хроматограммы
Разметкой будем называть определение начала пика и конца пика для всех интересующих нас пиков на хроматограмме. Разметка не представляет сложностей, если все пики аналитов хорошо разделяются, а дрейф базовой линии пренебрежимо мал (см. рис. 73). Если же эти условия не выполняются, то возникают определенные трудности.
Они вполне разрешимы, если мы имеем дело с чем-то одним: либо с неполным разделением, либо с дрейфом. При этом надо хорошо понимать, что мы в любом случае получим погрешность интегрирования – вопрос только в том, насколько большую.
Рассмотрим случай неполного разделения. Следует сразу оговориться, что в аналитических методиках с точным количественным определением, вообще говоря, неполное разделение – это «нештатная» ситуация. Здесь коэлюирование целевого соединения с примесью, дающей достаточно интенсивный сигнал, исключено. Тем не менее, для полуколичественного определения можно использовать хроматографические условия, не приводящие к полному разделению целевых соединений.
В этом случае необходимо понимать, что погрешность интегрирования тем больше, чем меньше разрешение и симметрия пиков. Но это еще не все. Погрешность также сильно зависит от соотношения высот неразделенных пиков. Она минимальна, если пики либо равны по высоте (см. рис. 75а), либо, напротив, один пик значительно превосходит по площади другой (см. рис. 75б). В случае большой разницы в площадях пиков погрешность интегрирования, очевидно, зависит от очередности элюирования и симметрии основного пика.
Если площади пиков примерно равны, то пики разделяют методом перпендикуляра: оба пика вначале размечают как один, а затем из долины (valley) между пиками опускают перпендикуляр на основание. Перпендикуляр расщепляет (split) пик на два пика.
Если площади значительно различаются, и минорный пик выходит на пологом склоне основного, то минорный пик размечают методом наездника: его начало и конец отмечают прямо на склоне основного пика.
Максимальная погрешность интегрирования по обоим приведенным методам соответствует случаям, когда один пик в несколько раз больше другого (см. рис. 75в,г,д). В этом случае метод перпендикуляра дает для минорного пика завышенный результат, а метод наездника – заниженный. Удовлетворительные результаты интегрирования в этой ситуации можно получить только при использовании численного метода аппроксимации, который, к сожалению, реализован не во всех программах обработки хроматографических данных.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Различные методы разметки не полностью разрешенных пиков: метод перпендикуляра (а), метод наездника (б), метод аппроксимации (д). www.chromforum.ru
Рисунок 75. Различные методы разметки не полностью разрешенных пиков: метод перпендикуляра (а), метод наездника (б), метод аппроксимации (д)
Теперь рассмотрим задачу разметки сложной хроматограммы из многих пиков, выходящих на фоне дрейфа базовой линии с нелинейным профилем (см. рис. 76а). Во-первых, сначала необходимо провести холостой анализ и получить бланк хроматограммы, чтобы наглядно представлять себе профиль базовой линии (см. рис. 76б).
Разметку надо проводить так, чтобы основания пиков сливались в ломаную линию, которая по форме как можно более точно повторяет базовую линию на бланке. При этом полученная «искусственная» базовая линия не должна пересекать долин между пиками, то есть при разметке не должно получаться отрицательных пиков. Так, например, хроматограмму на рисунке 76а из двенадцати пиков можно разметить, проведя между шестью точками пять оснований и опустив семь перпендикуляров (5 + 7 = 12). На приведенной хроматограмме пики элюируются прямо друг за другом, так что каждая точка одновременно является концом одного пика и началом следующего.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Вариант разметки сложной хроматограммы (а) при известном бланке (б). www.chromforum.ru
Рисунок 76. Вариант разметки сложной хроматограммы (а) при известном бланке (б)
Вообще, не получать бланк (хроматограмму на холостом анализе) в случае неполного разделения пиков – это грубая ошибка. Представим, что неопытный хроматографист провел разметку как на рисунке 39а без знания бланка, втайне надеясь, что профиль базовой линии соответствует рис. 39б – а на самом деле профиль линейный! Проведенная разметка, очевидно, в этом случае будет полностью ошибочна, а погрешность интегрирования составит десятки или даже сотни процентов.
Некоторые версии программного обеспечения (ПО) позволяют запоминать бланк и вычитать его из всех последующих хроматограмм; можно также дать команду ПО записывать все последующие хроматограммы с вычетом данного бланка. При проведении этой операции необходимо, конечно, проявлять бдительность и следить за тем, чтобы бланк оставался постоянным. Следует оговориться, что данная операция приводит не только к коррекции базовой линии, но и к вычитанию из хроматограммы всех или большей части системных пиков.
1.4.3. Основы качественного анализа. Способы идентификации соединений. Ложноположительный и ложноотрицательный результаты идентификации
Задача качественного анализа состоит в том, чтобы ответить на вопрос «содержится ли данное вещество в пробе?» Как правило, после этого вопроса добавляют закономерное «…в концентрации, большей предела обнаружения данным аналитическим методом». Результат качественного анализа может быть положительным (вещество обнаружено, идентифицировано) и отрицательным (вещество не обнаружено).
В хроматографии решение задачи качественного анализа достигается путем сравнения характеристик пиков на хроматограмме пробы с характеристиками пика чистого целевого соединения, который называется стандартом (standard) или стандартным образцом.
Доказать отсутствие целевого соединения в пробе в любом случае проще, чем его присутствие. Хроматография здесь ни при чем – это свойство более общего характера. Достаточно упомянуть, что отсутствие на хроматограмме пика на месте элюирования целевого вещества уже доказывает , что в пробе его нет.
Теперь представим, что мы все-таки обнаружили совпадение характеристик сигнала стандарта и одного из сигналов на хроматограмме. Всегда возможны как минимум два варианта: 1) сигнал принадлежит целевому веществу, 2) сигнал принадлежит другому веществу со схожими характеристиками. Проведем определение в других условиях: вторых, третьих и т.д. Чтобы доказать утверждение 2 (некоторое вещество-претендент не является целевым) необходимо, чтобы характеристики вещества-претендента и вещества-стандарта не совпали хотя бы в одном случае. Однако, чтобы в общем случае доказать утверждение 2 (вещество-претендент является целевым) необходимо провести действительно огромное исследование, выходящее за грани рутинной аналитики.
На практике, однако, существуют достаточно простые, минимальные по затратам процедуры подтверждения присутствия/отсутствия целевого вещества в пробе. Они обладают довольно высокой информативностью и, соответственно, надежностью. Начнем с приемов качественного анализа, которые основаны на такой универсальной характеристике как время удерживания вещества.
Надежность ее применения, безусловно, зависит от повторяемости. Если методика хроматографического разделения прошла валидацию (validation), то есть признана устойчивой (robust), то среднеквадратическое отклонение времен удерживания в одной серии анализов может составлять порядка 0.2% и менее. Однако, на практике разброс значений tR может быть и большим; в методиках нередко закладывают диапазон допустимых значений времен удерживания до 2% (см. рис. 77) в изократическом режиме (в градиентном – значительно меньше).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Сравнение времен удерживания для пика на хроматограмме и для пика стандарта. www.chromforum.ru
Рисунок 77. Сравнение времен удерживания для пика на хроматограмме и для пика стандарта
Какова бы ни была повторяемость – отличной или всего лишь удовлетворительной – в течение одной серии анализов необходимо отслеживать текущее время удерживания целевого вещества. Это делают для того, чтобы вовремя замечать возможные сбои в работе прибора, а также любые отклонения от его штатной работы, которые проявляются как систематический сдвиг времен удерживания. Технически подобный контроль осуществляется путем периодического анализа стандартного образца, который в данном случае выполняет функцию контрольной пробы. К примеру, когда в автосамплер закладывают серию образцов, то обычно ставят 1-3 анализа стандартного образца в начале серии (для проверки градуировки, времени удерживания и его повторяемости) и 1 анализ стандартного образца в конце серии (для подтверждения отсутствия значительного изменения времени удерживания в течение всего измерения). Эти действия относятся к внутрилабораторному контролю качества (quality assurance/quality control, QA/QC).
Итак, что касается отрицательной гипотезы, то при правильно разработанной процедуре анализа (отсутствии потерь аналита в процессе инструментального анализа и/или на стадии подготовки пробы) отсутствие пика аналита на хроматограмме является необходимым и достаточным условием отрицательного результата.
Тем не менее, в том случае, когда отрицательный результат является неожиданным, отрицательную гипотезу можно проверить. Наиболее простой способ состоит в проведении дополнительного анализа пробы с добавкой стандарта (spike). Для принятия решения – следует ли проводить эту процедуру в конкретном случае – специалист должен руководствоваться здравым смыслом или методикой, если текст методики включает соответствующие указания (в разделе QA/QC).
Для подтверждения положительной гипотезы совпадение времени удерживания является условием необходимым, но не достаточным. Рассмотрим ситуацию, при которой на хроматограмме есть пик, время выхода которого совпадает со временем удерживания целевого соединения. Во-первых, какими способами можно проверить положительную гипотезу, основываясь только на времени удерживания?
Для начала рассмотрим все возможные варианты, соответствующие этой ситуации. Их, строго говоря, три. Первый: пик действительно является пиком целевого вещества. Второй: пик относится к другому веществу с очень похожим временем удерживания. Третий вариант: мы наблюдаем наложение двух или большего числа пиков, один из которых принадлежит целевому веществу.
Первое действие, очень простое и действенное: следует внимательно посмотреть на форму пика. Пик должен иметь неискаженную форму, близкую к Гауссовой кривой. Если на пике есть видимые перегибы – это довод в пользу третьего варианта, то есть, скорее всего, наблюдается наложение пиков. Ни качественный, ни, тем более, количественный анализ в этом случае провести нельзя: необходимо достичь лучшего разделения.
Допустим, что пик внешне не выглядим искаженным, без перегибов. Тогда можно провести дополнительный анализ пробы с добавкой стандарта, и опять посмотреть на форму пика. Искаженная форма пика или появление второго максимума свидетельствует в пользу второго варианта, т.е. пик на хроматограмме, скорее всего, не относится к целевому веществу.
Более серьезным испытанием является проведение анализа в иной хроматографической системе с отличающейся селективностью (см. рис. 78). Немного изменить селективность разделения можно, например, применяя неподвижную фазу другого типа в том же хроматографическим режиме; при этом вид хроматограммы изменится. Если положительная гипотеза верна, то времена удерживания для пиков претендента и стандарта совпадут и в этом случае. Более того, анализ пробы с добавкой стандарта также даст положительный результат.
Описанный подход может быть прописан и непосредственно в хроматографической методике. Как правило, один или несколько дополнительных возможных условий разделения прописывают в случаях, когда ни в каких определенных условиях нельзя исключать возможности коэлюирования целевых веществ с теми или иными примесями, компонентами матрицы и т.д.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Тест на ложноположительный результат идентификации при помощи изменения селективности системы:(а) разделение в основной хроматографической системе, (б) разделение в альтернативной системе с отличающейся селективностью. www.chromforum.ru
Рисунок 78. Тест на ложноположительный результат идентификации при помощи изменения селективности системы:(а) разделение в основной хроматографической системе, (б) разделение в альтернативной системе с отличающейся селективностью
Описанные выше приемы качественного анализа универсальны в том смысле, что не зависят от типа применяемого детектора. В случае необходимости их можно применять, работая на любом хроматографическом оборудовании.
При выполнении же рутинных анализов наиболее распространены другие приемы качественного анализа, которые основаны на дополнительной спектральной информации об элюируемых веществах. Ряд детекторов позволяют получать спектральные характеристики пиков, которые можно (и нужно) использовать для идентификации. Детекторами такого типа являются двухканальные и многоканальные детекторы: сканирующий спектрофотометрический детектор, спектрофотометрический детектор с диодной матрицей, сканирующий флуориметрический детектор, масс-спектрометрические детекторы.
Не дают никакой дополнительной информации об элюируемых веществах одноканальные детекторы: одноволновой спектрофотометрический, одноволновой (не сканирующий) флуориметрический, рефрактометрический, испарительный детектор светорассеяния, кондуктометрический и т.д. Для них применимы только те способы качественного анализа, которые основаны на времени удерживания соединений.
Наиболее распространенным детектором для рутинных определений является сканирующий спектрофотометрический детектор. «Сканирующий» обозначает то, что дифракционная решетка детектора способна поворачиваться и быстро «пробегать» набор позиций, отвечающих разным длинам волн. В результате детектор прописывает сразу несколько хроматограмм – каждую на своей длине волны поглощения. Высота пика на различных длинах волн поглощения неодинакова. Отношение высоты пика на одной длине волны к высоте этого пика на другой длине волны называется спектральным отношением.
Спектральное отношение – это простейшая спектральная характеристика пика. Конечно, для ее хорошей повторяемости необходимо тщательно соблюдать постоянство разметки хроматограммы. Необходимо также помнить, что повторяемость спектрального тем лучше, чем больше для пика отношение сигнал/шум.
Теперь вернемся к задаче подтверждения положительной гипотезы. Опять рассмотрим ситуацию, когда на хроматограмме время выхода одного из пиков совпадает со временем удерживания целевого соединения. Теперь мы можем сравнивать не только времена удерживания, но и спектральные данные для пиков претендента и стандарта.
В случае двухволнового спектофотометрического детектора мы должны сравнивать времена удерживания и спектральные отношения. Допустим, обе характеристики в первом приближении совпали (см. рис. 79а и 79б).
Следующим шагом следует проверить, что спектральное отношение одинаково во всех точках пика, например, в максимуме и на обоих склонах. Если пик соответствует одному веществу, то значительной разницы между спектральными отношениями в разных точках пика быть не должно (см. рис. 79в). Разница между спектральными отношениями в различных частях пика (см. рис. 79г) свидетельствует о коэлюирующейся примеси (или примесях).
Описанная процедура называется тестом на чистоту пика (peak purity test). Она может выполняться и автоматически специализированным программным обеспечением, если в качестве детектора применяется диодная матрица.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Применение спектральных отношений: а – хроматограмма образца, б – хроматограмма стандарта, в – положительный результат теста на чистоту пика, г – отрицательный результат теста на чистоту пика (комментарии в тексте). www.chromforum.ru
Рисунок 79. Применение спектральных отношений: а – хроматограмма образца, б – хроматограмма стандарта, в – положительный результат теста на чистоту пика, г – отрицательный результат теста на чистоту пика (комментарии в тексте)
Если целевое соединение идентифицировано, и все тесты на правильность идентификации, описанные в методике, успешно пройдены, заключение можно представить, к примеру, в следующей формулировке: «На основании результатов измерения, полученных с помощью [применяемый метод] на приборе [тип и конфигурация прибора] по методике [номер и название методики], сделано заключение, что [название аналита] соединение присутствует в пробе номер [шифр пробы]».
При наличии обоснованных сомнений в правильности идентификации можно прибегнуть к арбитражному методу (reference method). В жидкостной хроматографии в качестве арбитражного метода нередко применяют ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС). Ситуации, когда необходимо применять арбитражный метод, также могут быть зафиксированы в тексте аналитической методики.
Тем не менее, никакой, даже самый надежный и специфичный метод идентификации, не дает 100%-ной гарантии ее правильности. Каждый раз, приписывая определенному пику химическое соединение с определенной структурной формулой, мы высказываем гипотезу – более или менее достоверную. Вероятность ошибиться при проведении качественного анализа существует всегда.
Ошибочные результаты качественного анализа можно условно разделить на три группы: ложноотрицательные, ложноположительные и результаты ошибочной идентификации. Если целевое соединение присутствует в образце, но оно не найдено, результат анализа называют ложноотрицательным. Если целевого соединения в образце нет, но оно в нем найдено, то результат анализа называют ложноположительным. Случаи, когда целевому веществу приписывают пик другого соединения, или идентифицируют группу коэлюирующихся вместе с целевым веществ как чистое целевое вещество, относятся к ошибкам идентификации.
Ложноотрицательный результат, как правило, возникает при потере целевого вещества в процессе отбора пробы или подготовки пробы для анализа. Еще один возможный источник ложноотрицательного результата – деградация целевого вещества в пробе.
Ложноположительный результат является либо следствием ошибочной идентификации, либо возникает по причине загрязнения пробы целевым веществом из какого-либо внешнего источника. Внешним источником могут служить другие пробы и окружающая среда. Для случая, когда целевое вещество попадает в «чистую» пробу из другой пробы, существует целый ряд названий, не имеющих, к сожалению, общепринятого аналога в русском языке: эффект памяти (memory effect), кросс-контаминация (cross-contamination) и керри-овер (carry-over).
Единственный действенный подход в борьбе с высоким уровнем ошибочных результатов состоит в соблюдении процедур внутрилабораторного контроля качества измерений.