1.2.1. Полярность. Полярные и неполярные растворители и адсорбенты
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Ряд полярности растворителей, применяемых в жидкостной хроматографии. www.chromforum.ru
Рисунок 10. Ряд полярности растворителей, применяемых в жидкостной хроматографии
Предлагаю начать химический экскурс с обзора растворителей, которые чаще всего применяются в хроматографии для приготовления элюентов. Чтобы как-то отличать их друг от друга, сразу припишем каждому растворителю свойство полярности (polarity). Думаю, сейчас вполне достаточно воспринять его суть интуитивно: нечто, обладающее высокой полярностью, хорошо растворяется в воде, а обладающее низкой полярностью – в жире, бензине и т.д.
Все, кто имел дело с масляной краской, меня хорошо поймут. Руки, запачканные в краске, водой не ототрешь никак. Слегка лучше спиртом, но на самом деле надо брать олифу, скипидар, бензин – то есть углеводороды. А вот рубашку с пятном от сока клюквы надо срочно промывать водой и ничем другим. Все это потому, что масляная краска, скипидар, бензин – неполярные вещества, а красители клюквы, вода, спирт – полярные. Неполярное отмывается неполярным, а полярное полярным – все логично. Как мы потом увидим, хроматография вообще имеет очень забавное сходство со стиркой, и к этой аналогии мы еще вернемся.
Итак, в хроматографии применяется целый ряд растворителей различной полярности. Самый полярный из привычных растворителей – это вода. Самый неполярный – гексан (один из компонентов бензина). Где-то посередине между ними – ацетон и изопропиловый спирт, которые могут неограниченно смешиваться и с гексаном, и с водой (см. рис. 10).
Свойством полярности обладают и адсорбенты – впрочем, как и любой материал. Капните воду на сковороду с тефлоновым покрытием – вода сожмется в плотный шарик. Это потому, что она не смачивает поверхность, не хочет с ней хорошо взаимодействовать. Вода полярная, а тефлон – нет. То есть если сделать из тефлона адсорбент, то он будет неполярным. Кстати, это не шутка – адсорбенты из тефлона широко применяются в газовой хроматографии.
А вот со стеклом – наоборот. Вода растечется по стеклу тонким слоем. Вода полярная, и стекло полярное – они активно взаимодействуют. Адсорбент из стекла тоже будет полярным.
И, кстати, это тоже не шутка. Даже более того, «стеклянные» адсорбенты – самые широко применяемые в жидкостной хроматографии. Они называются силикагелями (silica gel). Вообще говоря, они имеют структуру не стекла, а кварца, то есть песка – но здесь, наверное, это можно считать уже тонкостями. Раньше силикагель получался осаждением геля кремниевой кислоты щелочью из водного раствора силикатов. Полученный гель высушивался – и в результате получали порошок силикагеля, обладающий высокой пористостью и удельной внутренней поверхностью до 600 м2 на грамм адсорбента. Современный способ синтеза силикагеля немного другой, но не в этом суть.
Главное то, что на основе силикагеля путем проведения химических реакций (химического модифицирования) промышленно получают широкий спектр адсорбентов самой разной полярности – от полярных амино-силикагеля и циано-силикагеля до неполярного С18 (читается «це восемнадцать»), или октадецил-силикагеля (см. рис. 11). Неполярный С18 силикагель фактически представляет собой силикагель, покрытый С18 углеводородом, то есть тончайшей прочной пленкой машинного масла!
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Адсорбенты, применяемые в жидкостной хроматографии. www.chromforum.ru
Рисунок 11. Адсорбенты, применяемые в жидкостной хроматографии
1.2.2. Как происходит удерживание. Что значит «нормальная фаза» и «обращенная фаза»? Элюирующая сила растворителя. Применение для элюирования смесей растворителей различной полярности. Компоненты элюента
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема взаимодействий в жидкостной системе. www.chromforum.ru
Рисунок 12. Схема взаимодействий в жидкостной системе
В газовой хроматографии удерживание вещества на адсорбенте определяется исключительно взаимодействием этого вещества и адсорбента. Десорбировать вещество можно только увеличив тепловое движение его молекул, то есть подняв температуру.
Допустим, адсорбент – это пористая сажа, а адсорбат – углеводород (к примеру, октан). Сажа очень хорошо адсорбирует октан за счет так называемых дисперсионных взаимодействий. Чтобы пик октана вообще вышел из колонки в приемлемое время, надо нагреть ее до температуры в двести-триста градусов, не меньше.
В жидкостной хроматографии картина немного сложнее. Адсорбат взаимодействует и с адсорбентом, и с элюентом. В результате, удерживание определяется разностью двух взаимодействий (см. рис. 12).
Если в приведенном примере заменить газовую хроматографию жидкостной, а в качестве элюента применять также углеводород (например, гексан), то октан будет элюироваться с пористой сажи даже при комнатной температуре. «Удерживающее» взаимодействие октана с неподвижной фазой, сажей, будет в значительной мере компенсироваться его «десорбирующим» взаимодействием с подвижной фазой, гексаном. А вот водой октан с сажи не смывается, и даже спиртом (этанолом или пропанолом) смывается только при дополнительном нагревании.
Мораль такова: в жидкостной хроматографии мы всегда можем компенсировать взаимодействие «адсорбат-адсорбент» другим взаимодействием «адсорбат-элюент». Причем ровно в такой мере, в которой нам необходимо для приемлемого удерживания целевого соединения. Именно так осуществляется регулирование времени удерживания в жидкостной хроматографии – путем подбора состава элюента, при котором достигается хороший баланс двух сил, двух взаимодействий. Если подвижная фаза подобрана правильно, то никого дополнительного нагревания не требуется.
Хроматографисты шутливо называют этот принцип «подержать и отпустить». Правильно подобранный элюент не должен ни резко смывать вещество с адсорбента, ни оставлять его на адсорбенте. Все должно смываться, но постепенно.
Теперь еще один мысленный эксперимент. Представим, что молекула любого вещества (адсорбата) состоит из двух частичек – полностью неполярной (черного цвета) и полностью полярной (белого цвета). То есть получается такая несимметричная черно-белая гантелька. У более полярных веществ белая долька больше, а черная меньше, а у более неполярных – наоборот.
Идем дальше. Допустим, у нас есть абсолютно неполярный адсорбент (черная поверхность) и абсолютно полярный адсорбент (белая поверхность). Если запустить смесь разных молекул-гантелек рядом с поверхностью-адсорбентом, то они будут притягиваться к ней. Белые дольки будут «липнуть» к белой поверхности, а черные дольки – к черной поверхности.
В результате реального хроматографирования на полярном, «белом» адсорбенте мы увидим, что пики разделяемых веществ выходят в порядке увеличения их полярных, белых долек. При хроматографировании же на неполярном, «черном» адсорбенте мы увидим более интересную картину: пики веществ выходят не в порядке увеличения их неполярных, черных долек, а в порядке увеличения разницы "черная долька минус белая долька".
И не надо думать, что эти последовательности будут копировать друг друга с точностью до наоборот. Нет, большая черная долька у молекулы совершенно не означает, что белая будет маленькой! В общем случае, мы получим две совершенно различные последовательности элюирования (см. рис 13).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Интуитивно понятная схема, иллюстрирующая порядок элюирования веществ в нормально-фазовой и обращенно-фазовой хроматографии. www.chromforum.ru
Рисунок 13. Интуитивно понятная схема, иллюстрирующая порядок элюирования веществ в нормально-фазовой и обращенно-фазовой хроматографии
Хроматографическая система, основанная на «белом», полярном адсорбенте, называется нормально-фазовой, НФ (normal-phase, NP), а основанная на «черном», неполярном – обращенно-фазовой, ОФ (reversed-phase, RP).
Почему такие странные названия? Наверное, потому, что вначале пользовались в основном полярными адсорбентами, и это казалось нормальным. А неполярными стали пользоваться позже. Там поначалу все казалось каким-то странным и вывернутым наизнанку – обращенным. Названия переделывать было лень, поэтому они закрепились. Мы еще не раз будем сталкиваться с подобными необычными названиями.
Теперь выясним, какие смеси растворителей применяют для приготовления элюентов в нормально-фазовой, а какие – в обращенно-фазовой хроматографии.
Начнем с обращенной фазы, здесь объяснение будет проще. Помните руки, запачканные масляной краской? Если да, то хорошо. Теперь будет примерно то же самое, но руки будут запачканы разными маркерами, то есть маркерами разных цветов. Вот это и есть наша мысленная обращенно-фазовая колонка с неполярным адсорбентом, на которой разделяют смесь красителей.
Если попытаемся отмыть руки водой – ничего не получится (аналиты не элюируются). Возьмем спирт – все мгновенно ототрется (все пики, не разделившись, выходят в нулевое время). Теперь надо вспомнить принцип «подержать и отпустить»: в хорошей хроматографии все должно смываться, но постепенно. Добавим в воду немного спирта и начнем оттирать маркер с рук. Сначала, допустим, «поплывет» красный краситель, потом синий, потом зеленый. По аналогии, это будет соответствовать получению трехкомпонентной хроматограммы на рисунке 1. Таким образом, чтобы добиться подходящих условий хроматографирования, приемлемых времен удерживания, нам пришлось смешать два растворителя – воду и спирт.
Этого примера вполне достаточно, чтобы пополнить наш лексикон порцией новых терминов. Основной компонент элюента (растворитель) будем назвать основой. Второй, дополнительный компонент элюента будем называть добавкой.
В приведенном выше примере основой элюента была вода, а добавкой – спирт. В обращенно-фазовой хроматографии основа – это всегда более полярный растворитель, чем добавка. То есть мы можем говорить о полярной основе и неполярной добавке (см. рис. 14). Чем больше в элюенте доля неполярной добавки, тем меньше удерживание.
В обращенно-фазовой хроматографии применяют неполярный адсорбенты. Самый распространенный тип адсорбента для ОФ ВЭЖХ – это С18 силикагель. Самая распространенная основа элюента – вода или водно-солевой буфер. В качестве неполярной добавки часто применяется ацетонитрил и метанол, реже – тетрагидрофуран или изопропиловый спирт, обладающие в ОФ режиме весьма высокой элюирующей силой.
Немного отвлечемся от основной темы для одного небольшого, но важного замечания. Очевидно, что добавка всегда имеет большую элюирующую силу, чем основа. Органические растворители, используемые в качестве добавок, можно расположить в ряд по возрастанию их элюирующей силы. Такой ряд называется элюотропным рядом.
Элюотропные ряды для обращенно-фазового и нормально-фазового режимов различны, если не сказать – противоположны. На рисунке 10 элюирующая сила для нормально-фазовой хроматографии растет «сверху вниз», в порядке увеличения полярности растворителя. Для обращенно-фазовой хроматографии все обстоит наоборот: в грубом приближении, элюирующая сила растет «снизу вверх», по мере уменьшения полярности растворителя.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема приповерхностного слоя в обращенно-фазовой системе. www.chromforum.ru
Рисунок 14. Схема приповерхностного слоя в обращенно-фазовой системе
Теперь обратимся к нормально-фазовой хроматографии. Если говорить очень поверхностно, то здесь все обстоит наоборот относительно ОФ варианта. В НФ ВЭЖХ применяют полярные адсорбенты; наиболее распространенным адсорбентом является немодифицированный силикагель.
Основой элюента является менее полярный растворитель, чем добавка, которая на этот раз называется полярной добавкой. Удерживание веществ тем меньше, чем выше доля полярной добавки в элюенте.
Дальше сложнее. Нормально-фазовые системы разделяются на «классические» нормально-фазовые и гидрофильные (HILIC, hydrophilic interaction chromatography).
Начнем с «классической» нормально-фазовой хроматографии. Вместо грязных рук представим теперь белую рубашку с желтым пятном от одеколона. Рубашка состоит из целлюлозы, то есть аналог полярного адсорбента. Пигменты одеколона – вещества средней полярности.
Смыть пятно водой не получится хотя бы потому, что в воде эти вещества даже не растворяются. Нет, здесь максимально полярный растворитель, который имеет смысл применять – это тот же спирт. Он вычистит пятно моментально. Чтобы в лучших хроматографических традициях пятно чистилось подольше, надо немного спирта (полярная добавка) смешать, например, с гексаном (неполярная основа). Надеюсь, здесь все ясно.
Вообще, основой элюента в «классической» нормально-фазовой хроматографии, как правило, является именно гексан. В качестве полярной добавки можно применять множество растворителей: простые эфиры (диоксан, тетрагидрофуран), сложные эфиры (этилацетат), алкилхлориды (хлороформ, хлористый метилен), кетоны (ацетон), часто спирты (особенно изопропиловый спирт, который неограниченно смешивается с гексаном).
Элюирующая сила растворителя для нормально-фазовой хроматографии, если посмотреть на рисунок 10, растет «сверху вниз», то есть чем больше полярность растворителя, тем больше его элюирующая сила. Растворители до спиртов включительно применяются в «классике» НФ ВЭЖХ в качестве полярных добавок.
Растворители максимальной элюирующей силы: вода, уксусная кислота, триэтиламин (ТЭА) – являются модификаторами. В НФ ВЭЖХ так иногда называют полярную добавку, которая даже в небольших количествах сильно изменяет свойства хроматографической системы.
Термин «модификатор» указывает на то, что данный растворитель способен значительно модифицировать, изменять структуру поверхности адсорбента и, таким образом, значительно влиять на его свойства. В «классическом» варианте концентрация модификатора может изменяться от сотых долей процента до нескольких процентов. Молекулы модификатора образуют на поверхности полярного адсорбента адсорбционный слой модификатора (см. рис. 15). Одним из самых распространенных модификаторов в НФ ВЭЖХ является уксусная кислота.
Что произойдет, если оставить элюент для нормальной фазы двухкомпонентным, то есть формально обойтись без модификатора? Дело в том, что в реальности в применяемых растворителях всегда есть влага, вода. Само по себе это ни плохо, ни хорошо. Зато это однозначно плохо тем, что концентрацию остаточной влаги невозможно полностью контролировать.
В результате, полярность силикагеля (часто ее называют активностью) с течением времени неконтролируемо уменьшается, как и времена элюирования веществ в подобных двухкомпонентных системах – говорят, что времена удерживания «плывут». Для стабилизации удерживания в элюент как раз и добавляют модификатор, к примеру, 1% уксусной кислоты. Здесь срабатывает принцип «клин клином вышибают»: уксусная кислота вытесняет влагу из адсорбционного слоя и минимизирует ее влияние на удерживание.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема приповерхностного слоя в нормально-фазовой системе. www.chromforum.ru
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема приповерхностного слоя в обращенно-фазовой системе. www.chromforum.ru
Рисунок 15. Схема приповерхностного слоя в нормально-фазовой системе
Тройные элюенты с модификатором применяют только в хроматографии; для твердофазной экстракции и адсорбционной очистки применяют двухкомпонентные элюенты без модификатора. Это связано с тем, что адсорбционные картриджи или колонки с силикагелем, окисью алюминия, флоризилом или другими неорганическими адсорбентами используются только один раз. Каждый раз для проведения новой твердофазной экстракции берут свежую порцию полярного адсорбента. Строго определенная, неизменная активность «свежих» полярных адсорбентов обеспечивается хорошо разработанными процедурами их предварительной термической обработки и хранения.
Теперь перейдем к гидрофильной хроматографии. Здесь наш аналог неподвижной фазы, белая рубашка, загрязнена соком клюквы или свежей травы. Основное отличие от предыдущего случая – природные пигменты имеют очень высокую полярность. Спиртом такое пятно не ототрешь. Его можно смыть водой. Постепенно такое пятно отмывается смесью полярного органического растворителя и воды.
Таким образом, гидрофильная хроматография – это нормально-фазовая хроматография, но с гораздо более полярным элюентом для разделения чрезвычайно полярных веществ, многие из которых имеют природное происхождение. Основой элюента практически всегда является ацетонитрил, а полярной добавкой и модификатором одновременно – вода или водно-солевой буфер. Чем больше в элюенте воды, тем меньше удерживание; однако, доля воды в элюенте редко превышает 20-30%. Структура адсорбционного слоя в гидрофильной хроматографии – полимолекулярный слой, то есть на поверхности адсорбента образуется тонкая пленка воды.
1.2.3. Зависимость удерживания от состава элюента. Уравнение Скотта
Очень удобным количественным выражением зависимости удерживания от состава элюента, а точнее от доли добавки в его основе, является уравнение Скотта:
1/VR = A + B*Cдоб., где
VR – удерживаемый объем,
Cдоб. – доля добавки в элюенте,
А, В – коэффициенты.
По виду уравнения видно, что эта зависимость гиперболическая.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. «Классический» вид зависимости удерживания от концентрации добавки в элюенте (зависимость Скотта). www.chromforum.ru
Рисунок 16. «Классический» вид зависимости удерживания от концентрации добавки в элюенте (зависимость Скотта)
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Различные виды зависимостей удерживания от концентрации добавки в элюенте. www.chromforum.ru
Рисунок 17. Различные виды зависимостей удерживания от концентрации добавки в элюенте
На рисунке 16 приведены графики классических зависимостей Скотта для двух веществ, селективность которых при всех составах элюента остается неизменной. Конечно, нередко так оно и бывает, но далеко не всегда.
На рисунке 17а обе зависимости имеют классический вид, но селективность изменяется, и при больших концентрациях добавки даже изменяется порядок элюирования. Такие зависимости часто наблюдаются в «классической» НФ ВЭЖХ либо при применении спиртов в качестве полярной добавки, либо в тех случаях, когда полярная добавка имеет свойства модификатора.
На рисунке 17б обе зависимости имеют U-образный вид, что является признаком того, что в зависимости от состава элюента на одном и том же адсорбенте реализуются два различных вида хроматографии. Такой вид зависимостей очень характерен, например, для случая разделения гликозидов, имеющих полярную и неполярную части, на С18 фазах, также имеющих неполярные и полярные фрагменты. При низкой доле ацетонитрила в элюенте вода-ацетонитрил реализуется обращенно-фазовая хроматография, а при высокой – гидрофильная хроматография. Такие виды хроматографии часто называют смешанными (mixed mode).
На рисунке 17в в график одной зависимости имеет классический вид, а на другом виден резкий скачок при определенной доле добавки в элюенте. Такие случаи редки. Они встречаются в «классической» нормально-фазовой хроматографии, особенно на хиральных фазах, и связаны с резкой перестройкой адсорбционного слоя, к которой разные вещества имеют разную чувствительность.
1.2.4. Обращенно-фазовая хроматография. Примеры ОФ систем. Ион-парный ОФ режим
Самая главная задача для начинающего специалиста – это, безусловно, в совершенстве освоить метод обращенно-фазовой хроматографии. Именно ОФ ВЭЖХ применяется для большинства определений, выполняемых методом жидкостной хроматографии.
Мы уже успели рассмотреть основные закономерности ОФ хроматографии, однако, все сказанное целиком и полностью справедливо лишь для нейтральных аналитов. Нейтральные соединения не являются ни кислотами, ни основаниями, они не ионизируются, и структура их молекулы не зависит от рН элюента, то есть от его кислотности (основности).
Для ионных соединений все обстоит немного сложнее, поскольку в зависимости от рН элюента они могут существовать в разных формах. Ионные (имеющие заряд) формы удерживается в ОФ режиме значительно хуже, чем молекулярные.
Рассмотрим самый простой вариант. Пусть аналит – это органическая кислота, в которой есть одна кислотная группа, например, бензойная кислота. Бензойная кислота в растворе может существовать в виде молекулы кислоты С6Н5СООН и в виде аниона бензоата С6Н5СОО-. У каждой кислоты есть показатель кислотности pKa. У сильных кислот pKa меньше (вплоть до отрицательных значений), у слабых – больше. Бензойную кислоту с pKa = 4.2 можно считать слабой кислотой.
При кислотности элюента рН = pKa концентрации молекулярной формы и ионной формы в растворе равны. Если «закислить» раствор сильной кислотой, добавив таким образом в раствор протонов Н+, равновесие сместится в сторону образования молекулярной формы бензойной кислоты. То есть сильная кислота подавит ионизацию слабой. Наоборот, если «подщелочить» элюент, но кислота практически целиком перейдет в анион. Для бензойной кислоты для этого достаточно просто нейтрального рН = 7 (см. рис. 18).
Для того, чтобы в ОФ хроматографии получить высокую эффективность разделения ионных соединений и стабильные времена их элюирования, необходимо по возможности выбирать такой рН элюента, чтобы все анализируемые соединения существовали исключительно в одной форме, молекулярной или ионной. Если при рН элюента какие-либо соединения будут существовать в разных формах, их пики будут уширены и искажены, а времена удерживания будут очень нестабильны.
Для получения узкого симметричного пика бензойной кислоты водную часть элюента достаточно «закислить» до рН = 3 (довести до рН 3). Часто для этого применяется фосфорная кислота. При таком рН большая часть (около 90%) бензойной кислоты существует в растворе в виде молекулярной формы, чего вполне достаточно для получения хорошей хроматограммы.
Вообще, рН = 2.5 более чем достаточно для ОФ хроматографирования большинства карбоксильных органических кислот. Меньший 2.5 рН применяется в исключительных случаях.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Равновесие форм бензойной кислоты в водном растворе при различных рН. Вид ОФ хроматограммы бензойной кислоты в зависимости от рН водной основы элюента. www.chromforum.ru
Рисунок 18. Равновесие форм бензойной кислоты в водном растворе при различных рН. Вид ОФ хроматограммы бензойной кислоты в зависимости от рН водной основы элюента
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограммы компонентов препарата "Аскофен" в обращенно-фазовом режиме при кислом (а) и нейтральном (б) рН. а) рН = 2.5, б) рН = 6.5. Нейтральные вещества: (1) парацетамол, (2) кофеин. Слабые кислоты: (3) салициловая кислота, (4) ацетилсалициловая кислота. www.chromforum.ru
- 19_1.jpg (18.48 Кб) Просмотров: 32815
Рисунок 19. Хроматограммы компонентов препарата "Аскофен" в обращенно-фазовом режиме при кислом (а) и нейтральном (б) рН. а) рН = 2.5, б) рН = 6.5. Нейтральные вещества: (1) парацетамол, (2) кофеин. Слабые кислоты: (3) салициловая кислота, (4) ацетилсалициловая кислота
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограммы компонентов препарата "Седалгин" в обращенно-фазовом режиме при нейтральном (а) и кислом (б) рН. а) рН = 6.5, б) рН = 2.5. Нейтральные вещества: (2) кофеин, (3) парацетамол, (5) фенобарбитал. Органические основания: (4) метиламиноантипирин - продукт деградации анальгина, (6) кодеин. www.chromforum.ru
Рисунок 20. Хроматограммы компонентов препарата "Седалгин" в обращенно-фазовом режиме при нейтральном (а) и кислом (б) рН. а) рН = 6.5, б) рН = 2.5. Нейтральные вещества: (2) кофеин, (3) парацетамол, (5) фенобарбитал. Органические основания: (4) метиламиноантипирин - продукт деградации анальгина, (6) кодеин
При рН 3 мы фактически получаем пик молекулярной формы кислоты (см. рис. 18а), при рН 7 – пик ионной формы кислоты (см. рис. 18в). Ионная форма кислоты удерживается в ОФ хроматографии гораздо хуже молекулярной и имеет меньшее время удерживания. Это логично – ведь заряженная форма гораздо полярнее незаряженной.
В ОФ хроматографии предпочитают переводить аналиты в молекулярную форму, а не в ионную: селективность разделения ионных форм в ОФ хроматографии хуже, чем молекулярных. К тому же, пики ионных форм, как правило, в большей или меньшей степени уширены и/или асимметричны.
Теперь разберем пример разделения в ОФ режиме органических оснований. По идее, для этого надо применять элюенты с «щелочным» рН порядка 10-11 единиц. Но на практике так поступают крайне редко. Почему? Так сложилось, что самым распространенным обращенно-фазовым адсорбентом является С18 силикагель, а все силикагели не переносят щелочной среды – они просто постепенно в ней растворяются. Так что щелочные элюенты используют лишь при работе на полимерных адсорбентах, которые, в свою очередь, применяются нечасто из-за относительно низкой эффективности, а также из-за из дороговизны.
Таким образом, при работе на С18 силикагелях мы с самого начала поставлены перед фактом: разделять органические основания приходится в виде их ионных форм, то есть органических катионов. Здесь есть две проблемы. Первая заключается в том, что селективность разделения ионных форм хуже, чем молекулярных; однако, эта проблема не кажется слишком большой.
Вторая проблема серьезнее: пики оснований нередко элюируются с С18 силикагелей при нейтральных и «кислых» рН в виде широких, асимметричных пиков. Во многих случаях это связано с недостаточным качеством адсорбента.
Согласно общепринятой точке зрения, уширение пиков оснований происходит в результате взаимодействия аналитов с примесями металлов и активными силанольными группами, присутствующими на поверхности адсорбента. Активная силанольная группа отличается от обычной тем, что около нее находится примесь металла. В результате, почти нейтральная группа Si-OH приобретает довольно высокую кислотность.
Идея борьбы с нежелательными взаимодействиями может очень напомнить нам нормально-фазовую хроматографию: в элюент вводят модификатор в концентрации 1-2% – так же, как и в НФ варианте (см. рис. 21б). Только на этот раз модификатором является алифатический амин, как правило, триэтиламин, ТЭА, или диэтиламин, ДЭА.
Если применение модификатора не дает никакого эффекта, то уширение пика в наблюдаемом случае не связано напрямую с качеством адсорбента.
Современные адсорбенты на основе силикагеля обладают достаточно высоким качеством, и зачастую даже без применения модификатора удается добиться вполне удовлетворительной формы пиков огранических оснований. Однако, для устаревших силикагелей, выпущенных в 80-е и 90-е годы, уширение пиков оснований может являться серьезной проблемой. Более того, без применения модификаторов в составе элюента органические основния могут вообще не элюироваться с колонки.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема действия модификатора в ОФ хроматографических системах: а – система без модификатора, б – система с модификатором. www.chromforum.ru
Рисунок 21. Схема действия модификатора в ОФ хроматографических системах: а – система без модификатора, б – система с модификатором
Теперь рассмотрим случай, когда в пробе есть и нейтральные соединения, и органические кислоты, и органические основания. Допустим, в водную основу элюента мы решили добавить модификатор, 1% ТЭА, и довести ее рН до 2.5-3 фосфорной кислотой. В результате и пики оснований, и пики кислот будут уширены минимально – даже при условии не очень качественного С18-силикагельного адсорбента.
На рисунке 22 показано, как хроматограмма смеси веществ будет изменяться при доведении элюента до кислого рН, а также при добавлении в него модификатора (при условии низкого качества адсорбента).
Вообще, данную ОФ систему: адсорбент С18 и элюент органический растворитель-(1% водный раствор ТЭА, рН 2.5 фосфорной кислотой) –можно назвать универсальной ОФ системой в том смысле, что она применима для разделения большинства органических соединений. Конечно, не всегда она применима, и далеко не всегда оптимальна – иначе других видов хроматографии просто бы уже не существовало. Но по универсальности, наверное, ей пока нет равных.
Применение этой системы, тем не менее, подразумевает ряд ограничений, например, на способы элюирования и детектирования. Поскольку элюент содержит модификатор, система ограниченно совместима с градиентным элюированием и несовместима с МС детектированием, что уменьшает ее ценность как системы для скринингового анализа.
Кроме того, чем больше добавок органических соединений содержит элюент, тем больше на хроматограмме возникает так называемых системных пиков (system peaks) – даже в изократическом режиме элюирования. Системные пики не связаны компонентами пробы. Они вызваны возмущением сложных адсорбционных равновесий в хроматографических системах с модификатором, которое происходит в момент ввода пробы. Ситуацию может осложнить то, что их интенсивность и время «выхода» на хроматограмме может зависеть от состава растворителя пробы.
Системные пики могут быть как положительными, так и отрицательными (т.е. направленными «вниз»). Как правило, интенсивность системных пиков (при применении УФ детектирования) возрастает при уменьшении длины волны детектирования. Большая часть системных пиков, как правило, занимает область в начале хроматограммы k’ ≤ 2.
Таким образом, при УФ детектировании системные пики могут стать проблемой в тех случаях, когда одно или несколько целевых веществ: а) имеют слабое поглощение, б) поглощают только в области коротких длин волн, в) их концентрация в пробе невелика, г) в выбранных условиях они имеют низкое удерживание.
Осталось сказать, что «универсальная» ОФ система может быть немного модифицирована для случая, когда органические основания удерживаются слишком слабо. В этом случае в элюент можно внести второй модификатор – ион-парный реагент (ion-pairing reagent). Для увеличения удерживания оснований в водный буфер делают добавку алкилсульфоната: гексил-, гептил, октил или децилсульфоната натрия – в концентрации порядка 5-10 мМ (миллимоль/литр).
Алкилсульфонаты – это соли органической кислоты. Они достаточно хорошо удерживаются на неполярном адсорбенте, сообщая ему некоторый отрицательный заряд. Как следствие, удерживание оснований, которые находятся при «кислом» рН в форме катионов, возрастает. Режим хроматографирования с применением ион-парной добавки называют ион-парным, в данном случае – ион-парным обращенно-фазовым (ion-pairing RP mode).
Фактически, ион-парный режим представляет собой гибрид обращенно-фазовой и ионной хроматографии. Этот гибридный режим применяется на практике достаточно часто. В последнее время, однако, его все реже реализуют на С18 силикагеле с применением ион-парной добавки. Сейчас в практику активно входят адсорбенты, сочетающие неполярные фрагменты с ионообменными группами (к примеру, силикагели, сочетающие С18 и С3СООН прививки), так что необходимость ион-парной добавки в элюент отпадает.
Режим хроматографирования на подобных адсорбентах можно назвать смешанным: обращенная фаза и ионный обмен (reversed-phase/ion exchange chromatography, RP/IEС). Этот режим, к примеру, часто применяется для разделения смесей нейтральных и ионных ПАВ; нередко он применяется и при анализе комплексных фармацевтических препаратов.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Изменение ОФ хроматограммы смеси нейтральных, кислотных и основных веществ в зависимости от состава водной основы. www.chromforum.ru
Рисунок 22. Изменение ОФ хроматограммы смеси нейтральных, кислотных и основных веществ в зависимости от состава водной основы
В завершение привожу таблицу с возможными составами наиболее распространенных ОФ элюентов для С18 силикагеля – в порядке увеличения элюирующей силы (см. табл. 1). Вещества перечислены в типичном порядке их элюирования.
Таблица 1. Примеры «универсальных» ОФ систем, применяемых при работе на С18 силикагелях
Объект анализа
Элюент
Фруктовые органические кислоты (щавелевая, винная, аскорбиновая, молочная, уксусная, лимонная) 25 мМ водный раствор KH2PO4, pH 2 фосфорной кислотой
Водорастворимые витамины (аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, никотинамид, пиридоксин, тиамин, биотин, рибофлавин ) Ацетонитрил-(10 мМ водный раствор гептилсульфоната Na с 1% ТЭА, рН 2.5 фосфорной кислотой) 10:90
Природные алкалоиды (например, скополамин, атропин, бруцин) Ацетонитрил-(1% водный раствор ТЭА, рН 3 фосфорной кислотой) 15:85
Ацетонитрил-(1% водный раствор ТЭА, рН 7 фосфорной кислотой) 30:70
Бензойная кислота, сорбиновая кислота, другие ароматические кислоты Ацетонитрил-(вода, рН 2.5 фосфорной кислотой) 20:80
Фармацевтические препараты (парацетамол, кофеин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота), консерванты и подсластители (сахарин, кофеин, аспартам, бензойная кислота, сорбиновая кислота) Ацетонитрил-(1% водный раствор ТЭА, рН 2.5 фосфорной кислотой) 17:83
Пиридины и анилины Ацетонитрил-(1% водный раствор ТЭА, рН 3 фосфорной кислотой) 50:50
Фармацевтические препараты (трициклические антидепрессанты) Ацетонитрил-(1% водный раствор ТЭА, рН 3.5 фосфорной кислотой) 60:40
1.2.5. Изократическое и градиентное элюирование. Техника градиентного элюирования. Общие рекомендации по проведению градиентного элюирования
Существуют два способа элюирования: изократический и градиентный. При изократическом элюировании (isocratic elution) для хроматографирования применяют элюент постоянного состава. При градиентном элюировании (gradient elution) состав элюента программируемо изменяется в течение анализа – как правило, происходит постепенное увеличение в элюенте доли добавки, обладающей более высокой элюирующей силой.
Изократическое элюирование применяют чаще градиентного. В аппаратурном плане оно требует наличия по крайней мере одного насоса высокого давления с одной линией для забора элюента (без смесителя). Такую простейшую насосную систему называют изократической. Привлекательность такой системы состоит в ее бюджетности. Ее главное неудобство состоит в том, что она ограниченно применима в тех случаях, где градиентное элюирование дает явное преимущество: при скрининге, или если необходимо промывать колонку после каждого анализа. Кроме того, элюент необходимо смешивать вручную, а при отсутствии дегазатора – также вручную дегазировать.
Оптимальной по соотношению цена/качество системой для работы в изократическом режиме является так называемая градиентная система со смешиванием в области низкого давления. Она состоит из одного насоса высокого давления с программируемым смесителем и дегазатором. Часто смеситель и дегазатор размещают в едином блоке; его устанавливают до насоса, то есть на стороне низкого давления – чем и обусловлено название системы. Программируемый смеситель позволяет управлять смешиванием элюента из трех или четырех заборных линий. Таким образом, смешивание и дегазирование элюента происходит автоматически.
Такая система не очень хорошо подходит, собственно, для высокопроизводительных градиентных анализов из-за внушительной задержки профиля градиента. Но для проведения анализов в изократическом режиме она подходит идеально. Во-первых, смешивание и дегазирование элюента происходит автоматически. Во-вторых, применение такой системы дает возможность автоматически промывать колонку после каждого анализа.
Хотя промывка и увеличивает общую продолжительность анализа, без нее бывает сложно обойтись в тех случаях, когда образцы комплексные, и после целевых соединений элюируются множество других веществ. В таких ситуациях необходимо либо ждать выхода всех интенсивных пиков после целевых соединений (что приводит к явному увеличению времени анализа, и к тому же не решает проблему гарантированно), либо следует программировать в конце анализа промывку колонки.
Попытка в таких случаях не обращать внимания на проблему, то есть просто останавливать хроматограмму после выхода целевых соединений и начинать новый анализ, чревата закономерными неприятными последствиями. Интенсивные пики компонентов уже проанализированных проб (часто говорят – пики от предыдущих инжекций) начнут постепенно элюироваться и накладываться на рабочие хроматограммы, что серьезно осложнит количественный анализ, и в какой-то момент просто сделает его невозможным (см. рис. 23).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Хроматограмма лимонного сока в обращенно-фазовом режиме. (1) Лимонная кислота, (2) коэлюирующийся пик от предыдущей пробы. (а) Хроматограмма, полученная при анализе без стадии промывки; (б) хроматограмма, полученная со стадией промывки колонки. www.chromforum.ru
- 23_1.jpg (18.77 Кб) Просмотров: 32815
Рисунок 23. Хроматограмма лимонного сока в обращенно-фазовом режиме. (1) Лимонная кислота, (2) коэлюирующийся пик от предыдущей пробы. (а) Хроматограмма, полученная при анализе без стадии промывки; (б) хроматограмма, полученная со стадией промывки колонки
Программируемая промывка осуществляется путем программирования в конце анализа ступени «элюента» с повышенной долей добавки, которая имеет более высокую элюирующую силу и выполняет в данном случае роль «промывочной жидкости». За промывочной ступенью следует третья ступень с основным элюентом, применяемым для проведения разделения. Третья ступень необходима для кондиционирования колонки перед проведением очередного анализа (см. рис. 24).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. рофиль элюирования для изократического анализа со стадиями промывки и кондиционирования колонки. www.chromforum.ru
Рисунок 24. Профиль элюирования для изократического анализа со стадиями промывки и кондиционирования колонки
В некоторых случаях бывает полезно дополнительно сконцентрировать пробу прямо на колонке, то есть после инжектирования (т.н. on-column концентрирование) – и в этом также может помочь градиентная система. В этом случае колонку сначала кондиционируют элюентом с пониженной долей добавки, то есть ступенью с пониженной элюирующей силой. Элюирующая сила растворителя пробы должна быть также пониженной. После инжектирования подают на колонку «обычный» элюент с нормальной элюирующей силой. Смысл этого подхода состоит в том, чтобы сузить хроматографическую зону пробы в самом начале колонки, прямо на старте анализа.
Подобный прием позволяет инжектировать значительные объемы пробы, в разы и даже десятки раз превышающих нормальные (например, до 200 мкл пробы на колонку типоразмера 250х4.6). Сам по себе этот подход, однако, применяется очень редко – значительно чаще его используют для хроматографирования в анализах с он-лайн твердофазной экстракцией.
Значительной экономии расхода элюента можно добиться применением простой изократической насосной системы в так называемой конфигурации рецикла элюента: жидкостную систему хроматографа замыкают, то есть направляют слив элюата обратно в емкость для отбора элюента (см. рис. 25).
Как правило, в руководствах по хроматографии этот технический прием однозначно признают несостоятельным, если вообще упоминают о нем. Тем не менее, в ряде случаев его применение может быть вполне оправдано.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Схема жидкостной системы с рециклом элюента. www.chromforum.ru
Рисунок 25. Схема жидкостной системы с рециклом элюента
Однозначно в приведенной на рисунке 25 конфигурации рецикл нельзя применять при определении минорных компонентов (например, примесей). Однако, при проведении рутинных определений существует техническое решение, позволяющее обойти этот запрет. Существуют коммерчески доступные устройства, которые позволяют программируемо перенаправлять элюат в слив в те моменты, когда на хроматограмме проявляются наиболее интенсивные пики. В остальное время, когда элюируются минорные компоненты, не способные в ощутимой мере «загрязнить» элюат, он перенаправляется обратно в емкость с элюентом.
Без подобного устройства, к сожалению, нельзя применять рецикл и в тех случаях, когда после проведения изократического анализа колонка программируемо промывается ступенью «элюента» с большей элюирующей силой.
Тем не менее, даже в самой простой реализации рецикл элюента оказывается вполне применим в случаях качественного или полуколичественного определения ряда основных компонентов в несложных образцах.
Для работы в рецикле, как правило, готовят единовременно не менее 200-300 мл элюента. Сначала может показаться, что «чистый» элюент будет очень быстро загрязняться компонентами пробы из элюата, но это не совсем верно. Достаточно сравнить объем пробы (порядка 10 мкл) и объем элюента (например, 300 мл, то есть 300000 мкл). Элюента больше в 30000 раз, то есть даже после проведении 100 определений уровень фона детектора увеличится на порядка 0.3% от оптической плотности пробы.
Таким образом, при «крупном» рабочем масштабе детектора постепенное загрязнение элюента может быть почти незаметным. Такое загрязнение обычно проявляется как небольшой постоянный дрейф базовой линии, плавный или в виде пологих ступеней.
При градиентном элюировании, как уже было сказано, состав элюента программируемо изменяется в течение анализа; как правило, в нем увеличивается доля добавки с высокой элюирующей силой. Программу изменения состава элюента часто называют профилем градиента. Начало хроматограммы соответствует слабому элюенту с низкой элюирующей силой, конец хроматограммы – сильному элюенту с высокой элюирующей силой.
Каждый отрезок профиля градиента называется ступенью. Ступень, на которой происходит увеличение элюирующей силы подвижной фазы, называется подъемом. Ступень, на котором элюирующая сила не меняется (участок изократического элюирования), называется плато.
Профиль градиента может быть ступенчатым, кусочно-линейным или непрерывным; непрерывный профиль в большинстве случаев бывает наиболее простым – линейным, хотя программа прибора, как правило, позволяет использовать и более сложные, выпуклые или вогнутые кривые (см. рис. 26). Последней ступенью градиента является кондиционирование – колонка заново кондиционируется слабым элюентом начального состава. После регенерации можно снова запускать градиентный анализ.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Варианты градиентного элюирования: (а) линейный, (б) ступенчатый, (в) кусочно-линейный, (г) задаваемый плавной функцией. www.chromforum.ru
Рисунок 26. Варианты градиентного элюирования: (а) линейный, (б) ступенчатый, (в) кусочно-линейный, (г) задаваемый плавной функцией
Оптимальной системой для работы в градиентном режиме является градиентная система со смешиванием в области высокого давления. Она состоит из двух насосов высокого давления со программируемым смесителем и дегазатором.
Смысл градиентного элюирования заключается в том, чтобы в рамках одного анализа добиться приемлемого (не слишком низкого, и не слишком высокого) времени элюирования для соединений, имеющих при изократическом режиме огромную разницу в удерживании (см. рис. 27).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Разделение смеси из сильно различающихся по удерживанию компонентов. Изократическое элюирование на слабом элюенте (а): хорошее разделение, но большая продолжительность анализа. Изократическое элюирование на сильном элюенте (б): быстрый анализ, но плохое разделение слабо удерживаемых компонентов. Градиентное элюирование (в): старт с более слабого элюента, чем (а), завершение при более сильном элюенте, чем (б): достаточное разделение, приемлемая продолжительность анализа. www.chromforum.ru
Рисунок 27. Разделение смеси из сильно различающихся по удерживанию компонентов. Изократическое элюирование на слабом элюенте (а): хорошее разделение, но большая продолжительность анализа. Изократическое элюирование на сильном элюенте (б): быстрый анализ, но плохое разделение слабо удерживаемых компонентов. Градиентное элюирование (в): старт с более слабого элюента, чем (а), завершение при более сильном элюенте, чем (б): достаточное разделение, приемлемая продолжительность анализа
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пример применения градиентного (линейного) элюирования для скрининга флавонолов в растительных образцах в обращенно-фазовом режиме. (а) Изократическое элюирование с применением среднего по силе элюента; (б) градиентное элюирование. www.chromforum.ru
Рисунок 28. Пример применения градиентного (линейного) элюирования для скрининга флавонолов в растительных образцах в обращенно-фазовом режиме. (а) Изократическое элюирование с применением среднего по силе элюента; (б) градиентное элюирокание
Градиентное элюирование, как правило, применяют для проведения скрининговых анализов, то есть в тех случаях, когда необходимо получить наиболее полную информацию об исследуемом образце (другими словами, когда необходимо «увидеть» максимум компонентов пробы). Цели скрининга при этом могут быть различными: это и получение «отпечатка пальцев» образца для его идентификации, и поиск неизвестных (например, потенциально токсичных) веществ в образце (см. рис. 28).
Тривиальными, не аналитическими применениями градиентного элюирования является on-column концентрирование пробы и промывка колонки после анализа (см. выше).
Наконец, градиентное элюирование можно применять и для рутинных определений, как правило, значительного числа целевых соединений в образце (групповое определение).
Нередко выбор в пользу градиентного элюирования бывает неоправданным. На практике можно встретить по крайней мере два типа таких ситуаций.
Случай первый – когда селективность разделения всех компонентов достаточно хорошая, критических пар на хроматограмме нет (см. рис. 29а). Здесь налицо просто избыточное удерживание. Градиент не требуется, достаточно увеличить элюирующую силу подвижной фазы (то есть увеличить долю добавки).
Случай второй, по симптомам обратный первому – селективность разделения для всех компонентов плохая (см. рис. 29б). Присутствуют критические пары, причем как в начале, так и в конце хроматограммы. Попытка адаптировать для такого разделения градиентный режим с плавным (например, линейным) профилем закончится неудачей: некоторые критические пары пиков перестанут разрешаться. Дело в том, что при градиентном элюировании падает селективность разделения; вследствие этого ухудшается и разрешение, даже несмотря на формальный рост эффективности.
Возможные решения проблемы – сделать профиль градиента ступенчатым (то есть скомбинировав несколько изократических ступеней с разной элюирующей силой, см. рис. 26б, либо вообще разбить разделение на два изократических. Например, первый изократический анализ можно проводить до момента элюирования 4-ого компонента с применением менее сильного элюента, а второй – с применением более сильного элюента, оптимального для разделения компонентов от 5-ого до 8-ого (первые четыре при этом будут элюироваться в начале хроматограммы не разделенными). Очевидно, для первого разделения в конце хроматограммы будет необходимо запрограммировать промывку колонки от компонентов 5-8.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Примеры разделений, где переход на градиентное элюирование может быть нецелесообразен. www.chromforum.ru
Рисунок 29. Примеры разделений, где переход на градиентное элюирование может быть нецелесообразен
Градиентное элюирование, как правило, бывает оправдано при необходимости разделить за один анализ достаточно большое число целевых соединений, сильно различающихся по величине удерживания. Вопрос заключается в том, какой профиль градиента будет оптимальным для того или иного случая. Ответ на этот вопрос зависит от расположения критических пар на хроматограмме.
Случай, когда критические пары есть на всех участках хроматограммы (и в начале, и в конце), мы уже рассмотрели. Здесь наиболее оптимальным будет ступенчатый градиент, то есть комбинация нескольких изократических участков (см. рис. 26б).
На рисунке 30 проиллюстрирован случай, когда критические пары элюируются в начале хроматограммы. Профиль градиента в этом случае должен быть вогнутым; не важно – кусочно-линейным или заданным непрерывной функцией (на рисунке – кусочно-линейным). Пока элюируются слабо удерживаемые и плохо делящиеся компоненты, необходимо поддерживать постоянный состав элюента (плато). Подъем должен находиться после начального изократического участка.
Случай, когда критические пары элюируются в конце хроматограммы, показан на рисунке 31. Профиль градиента здесь должен быть выпуклым: градиент надо начинать с самого начала, а в конце оставлять изократический участок.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пример применения вогнутого градиента. www.chromforum.ru
Рисунок 30. Пример применения вогнутого градиента
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Пример применения выпуклого градиента. www.chromforum.ru
Рисунок 31. Пример применения выпуклого градиента
И еще несколько комментариев по градиентному элюированию. Ступень кондиционирования. Когда начинается ступень кондиционирования, то сбор данных для записи в файл можно останавливать – анализ закончен. Но работа детектора не прекращается. На хроматограмме появляется резкий скачок базовой линии в тот момент, когда элюент начальной, слабой ступени, заполнив насос и колонку, доходит до детектора.
На кондиционирование колонки затрачивается некоторое время. Как правило, оно не меньше удвоенного нулевого времени, то есть через колонку должно пройти не менее двух объемов начальной ступени. Продолжительность кондиционирования можно считать достаточной, если за это время дрейф базовой линии практически (а именно – в используемом масштабе детектора) прекращается.
Задержка реального профиля градиента относительно запрограммированного. При подборе условий градиентного элюирования помните, что реальный профиль градиента всегда отстает от запрограммированного. Более того, есть как минимум два «реальных» профиля градиента: на входе в колонку и на выходе из колонки (см. рис. 32).
Так, профиль на входе колонки отстает от запрограммированного по той причине, что растворителю необходимо затратить время на прохождение участка жидкостной системы между линией забора отдельных растворителей и линией подачей готового элюента в колонку. Задержка градиента зависит от применяемой насосной системы: она больше для систем со смешиванием в области низкого давления и меньше для систем со смешиванием в области высокого давления.
Из-за задержки реального профиля градиента хроматографируемые соединения «чувствуют» увеличение элюирующей силы только через некоторое время после начала ступени подъема. По этой причине момент подъема градиента необходимо программировать с упреждением, корректируя его с учетом времени задержки.
Время задержки профиля градиента на входе колонки для данной жидкостной системы проще измерить на практике. К примеру, можно провести холостой опыт на системе, в которой инжектор соединен с детектором капилляром. На фотометрическом детекторе следует установить наиболее короткую длину волны. Время между началом холостого анализа и началом заметного дрейфа базовой линии будет соответствовать времени задержки профиля градиента.
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Профили градиента: запрограммированный (а), на входе в колонку (б), на выходе из колонки (в). www.chromforum.ru
Рисунок 32. Профили градиента: запрограммированный (а), на входе в колонку (б), на выходе из колонки (в)
Сужение хроматографических зон. При «крутом» и/или «затяжном» градиенте (то есть при большом перепаде элюирующей силы или продолжительном по времени подъеме) хроматографические зоны элюирующихся компонентов значительно сужаются. Таким образом, в конце подъема компоненты элюируются более узкими пиками, чем в начале.
Может показаться, что сужение пиков приводит, по сравнению с изократическими условиями, к улучшению разделения. Однако, это не соответствует действительности. Разрешение пиков в градиентном режиме, напротив, уменьшается – поскольку уменьшается селективность разделения.
Тем не менее, сужение пиков имеет свое преимущество: увеличивается высота пиков. Соответственно, возрастает отношение сигнал/шум и улучшается предел определения целевых веществ.
Экономия растворителей. При градиентном элюировании нельзя воспользоваться рециклом элюента, поэтому вопрос экономии растворителей надо решать другими путями.
Так, в градиенте лучше работать с микроколонками со внутренним диаметром 3 мм или 2 мм вместо традиционных 4.6 мм. Этот способ приводит к уменьшению объемной скорости расхода элюента до (4.6/2)2 ≈ 5.3 раз при той же линейной скорости. При применении микроколонок следует заменить аналитическую кювету фотометрического детектора на полумикро кювету. Падение чувствительности детектора из-за замены кюветы в градиентном режиме будет компенсироваться увеличением высоты пиков за счет сужения хроматографических зон.
Также следует помнить, что в градиентном режиме применение колонок большой длины ничем не оправдано. Оптимальный выбор для градиента – это 75-100 мм колонки, заполненные адсорбентом с 2-3 мкм зернением.
Применение в обращенно-фазовой хроматографии. Градиентное элюирование в принципе применимо для проведения рутинных анализов только в тех случаях, когда адсорбционное равновесие в системе устанавливается быстро, и свойства адсорбента не зависят от состава элюента.
Этим требованиям хорошо отвечает только обращенно-фазовая хроматография. Поэтому в подавляющем большинстве случаев градиентное элюирование применяется для выполнения определений в обращенно-фазовых условиях.
Чистота растворителей. Для градиентного элюирования необходимо применять самые чистые растворители, желательно марки «for chromatography» или аналогичные им. В изократическом режиме требования к чистоте растворителей также высоки, но для градиентного режима этот параметр становится критическим.
Первая причина заключается в том, что примеси в используемых для приготовления элюента растворителях вызывают дрейф базовой линии – поскольку состав подвижной фазы изменяется в течение анализа. В случае спектрофотометрического детектора величина дрейфа, как правило, резко увеличивается на коротких длинах волн < 250 нм.
Дрейф восходящий, если сильная (конечная) ступень градиента содержит больше УФ поглощающих примесей, чем слабая (начальная); в противном случае дрейф нисходящий. Если профиль градиента плавный, то и дрейф, как правило, плавный. Если градиент ступенчатый или кусочно-линейный, то дрейф может выглядеть как «ступени» и «пологие горбы».
Вторая причина состоит в том, что определенная доля примесей в «слабой» (начальной) ступени в начале анализа концентрируются на колонке, а затем элюируются при достижении более высокой элюирующей силы подвижной фазы. УФ поглощающие примеси элюируются в виде пиков на хроматограмме и, таким образом, мешают проведению определения.
Если растворители недостаточно чистые, то при проведении градиентного элюирования можно наблюдать наложение значительного дрейфа базовой линии и паразитных системных пиков примесей в элюенте. В случае применения ступенчатого градиента пики примесей часто элюируются на подъеме ступени (см. рис. 33).
- К. Сычев. Практический курс ВЭЖХ - жидкостной хроматографии. Рисунок 32. Вид базовой линии (б) на подъеме градиента (а) при применении грязных растворителей. www.chromforum.ru
Рисунок 33. Вид базовой линии (б) на подъеме градиента (а) при применении грязных растворителей
Основным источником примесей, элюирующихся в виде пиков, является слабая, начальная ступень градиента. Поскольку ее основным компонентом в ОФ хроматографии является вода или водносолевой буферный раствор, то чистоте используемой воды, солей и кислот следует уделить большое внимание.
Наиболее часто приходится встречаться с заблуждением, что после дистилляции вода становится чище, и, соответственно, ее без проблем можно использовать для градиентного элюирования. Это не совсем так. Вода, конечно, очищается от неорганических веществ. Но большая часть органических летучих примесей, ответственных за появление паразитных пиков, в ней остается. Более того, если после дистилляции воду пропускают через некачественный синтетический мембранный фильтр, или загрязненный, старый угольный фильтр, то вода может дополнительно загрязниться. Вообще, в идеальном случае воду для градиентного элюирования лучше закупать отдельно как растворитель для хроматографии (та же марка «for chromatography»).
Соли желательно также закупать специальные, марки «для хроматографии», или отдельно их перекристаллизовывать. При использовании спектрофотометрического детектора желательно использовать фосфорную кислоту, практически не поглощающую в УФ диапазоне > 190 нм.
Проблемы совместимости. По тем же причинам градиентное элюирование с применением УФ детектирования ограниченно совместимо или совсем не совместимо с использованием различных добавок в элюент: триэтиламина и прочих аминов, ион-парных реагентов, уксусной и трифторуксусной кислот и т.д.
Кроме того, градиентное элюирование не совместимо с рефрактометрическим детектированием из-за его высокой чувствительности к изменению состава элюента.
Дегазирование элюента. Все элюенты для градиентного элюирования необходимо предварительно дегазировать, даже если насосная система имеет дегазатор. Особенно хорошо воздух растворяется в воде и водных средах; по этой причине наиболее тщательно следует дегазировать слабую ступень ОФ элюента, обогащенную водной компонентой.
Выделение пузырьков воздуха из элюента при градиентном элюировании на УФ детекторе проявляется как резкие броски базовой линии (значительное увеличение шума на определенном участке хроматограммы). Как правило, это происходит в момент начала подъема градиента. Здесь имеется в виду реальный профиль градиента на выходе из колонки, то есть к запрограммированному времени подъема следует прибавить задержку профиля градиента на входе колонки и нулевое время.
Дегазатор значительно смягчает этот эффект, однако в большинстве случаев не убирает его полностью. Эффективность встроенного дегазатора возрастает при уменьшении объемного потока элюента, чего можно добиться применением колонок пониженного диаметра, например, 3 мм вместо 4 или 4.6 мм.
Растворенный воздух наиболее активно выделяется при смешивании ступеней ОФ градиента с сильно различающейся долей добавки органического растворителя. Причина заключается в том, что при смешивании воды с полярным растворителем растворимость воздуха резко снижается. Соответственно, максимальная интенсивность выделения воздуха наблюдается в том случае, когда смешиваются чистый водный буферный раствор и чистый органический растворитель.
Не смотря на это, часты случаи именно такого способа формирования градиента, когда в одну емкость помещают 100% водный компонент элюента, в другую емкость – 100% органический растворитель. Ступени градиента при этом – как слабая, так и сильная – формируются непосредственно в смесителе. Это решение удобно тем, что способствует сокращению трудозатрат (не надо готовить ступени элюента вручную), а также повышению точности приготовления элюента необходимого состава. Недостаток подобного решения состоит в том, что появляется высокая вероятность выделения воздуха в момент подъема градиента, что особенно заметно при детектировании на коротких длинах волн.
Основные недостатки градиентного элюирования. При разработке методик для рутинного анализа стараются по возможности избегать применения градиентного режима элюирования, предпочитая ему элюирование изократическое. Это объясняется суммой различных причин; рассмотрим их в примерном порядке уменьшения важности.
1. Градиентное элюирование является более сложным технически. К примеру, воспроизвести и/или адаптировать методику с изократическим элюрованием, например, получается значительно проще и быстрее, чем методику с градиентным элюированием – что очень немаловажно. По этой же причине применение градиентного режима подразумевает более высокие требования к квалификации оператора.
2. Градиентное элюирование с применением наиболее распространенного УФ детектирования имеет множество ограничений. К примеру, нельзя применять элюенты с добавками аминов, органических кислот, ион-парных реагентов. Нельзя применять рефрактометрическое детектирование. Существуют значительные технические трудности с применением УФ детектирования в области наиболее коротких длин волн < 220 нм.
3. Стоимость жидкостной системы выше. Для обеспечения нормальной работы в градиенте необходима система со смешиванием в области высокого давления, то есть вместо одного необходимы два насоса, плюс программируемый смеситель.
4. Стоимость растворителей также выше, поскольку в градиентном режиме применяют только наиболее чистые растворители марки «для хроматографии», и даже специальная особо чистая вода.
5. Ступень кондиционирования колонки повышает длительность анализа: на системах со смешиванием в области высокого давления – до трети, на системах со смешиванием в области низкого давления – до половины от всего времени анализа.