Нужна помощь по методике.

[Николай]

Здравствуйте Константин!
Возникла такая ситуация, знакомые микробиологи занимающиеся заквасками
попросили посмотреть в получившемся кефире полисахаридный состав. Я этим вопросом никогда не занимался
и чета даже не знаю с какой стороны подойти. Я так понимаю нужно применять гель-фильтрацию, а вот как дальше
чета сообразить не могу. Подскажите пожалуйста блок схему как двигаться в этом направлении и может литературу какую нибудь
посоветуете.

Спасибо!!!!

[Константин Сычев]

Николай, добрый день!
Просто забейте в гугл "Exopolysaccharides hplc determination pdf" - универсальный рецепт я так понял, что делают на колонке типа Repromer 2000 SEC c рефрактометром, фракции раскапывают, гидролизуют, и для каждой меряют еще обычный моносахаридный состав. А вообще это даже не полисахариды, а какая-то хитрая смесь полисахаридов с белками с мол.массой в несколько миллионов.

[Николай]

Добрый день,Константин!
Ужасы там всякие написаны))
Вопросов еще несколько появилось пока читал:
1) Калибровку по массе я так понимаю надо делать стандартами декстрана разной мм?
2) Во всех приведенных работах зарубежные товарищи работают с чистыми культурами бактерий, а тут вопрос померить в готовом продукте. А там жир, белков всяких разных куча чем бы это все убрать не повредив аналиты?

Спасибо!!!!

[Иван Стыскин]

1) Да, именно так. Набор стандартов на мол. веса.
2) Видимо нужна ТФЭ очистка, шприцевые фильтры и прочие танцы

[Константин Сычев]

Да, типа того вот неплохая статься с условиями http://www.biochemj.org/bj/363/0007/3630007.pdf
Ну, если пытаться упростить их выделение, а элюент оставить как у них (0.1М пов.соль), то вот этим вот раствором соли кефир разбавить, наверное нагреть на всякий случай, дальше фугнуть, пропустить через С18 патрончик для очистки. Ну, чего с проскочившими белками делать - хз. У казеинов мол. масса по идее меньше до 10 в 5ой, и на них можно просто не обращать внимания, разделению они помешать не должны. Там еще сывороточные белки, правда, есть, но они вроде еще меньше.. Можно в исследовательских целях сгородить систему из УФ и рефрактометра, чтобы эти полисахариды не перепутать на хроматограмме с белками. Больше навскидку ничего не скажу)
в той статье все ЯМР спектры приведены, да еще с полной расшифровкой - так что в финале промахнуться будет не так уж и просто

[Николай]

Ну для полной уверенности какую колонку и патрончики взять? Я Ивану заказ нарисую на этот предмет.

[Константин Сычев]

Хорошо, я повнимательнее посмотрю на выходных и здесь отпишусь

[Константин Сычев]

Николай, по идее Reprosil SEC 4000 450 A° 20 000 - 5 000 000 D 4 000 - 500 000 D http://www.dr-maisch.com/xedin.php?point=sec.html
только там размеры странные 250 x 4.6 mm и 750 x 4.6 mm... вот дура-то))) интересно сколько стоит) ну я честно не знаю почему такой странный размер... по идее, надо брать 750 x 4.6 mm, иначе не разделится) а С18 патрончики любые, типа биохимаковских
я бы дожидался разделения, а остаток выгонял в обратном направлении, только кран нужен 10-ходовой

[Николай]

Константин, спасибо за информацию!!!
Вот счастье то привалило на мою голову))
Еще немного помучаю вопросами) Можно немного информации про кран 10-ходовой,где его применять и для чего раньше как то не сталкивался с таким девайсом.

Спасибо!

[Константин Сычев]

Конечно) странность в том, что стандартные размеры 300х8 - типа того. А на 75см-ой - разделение 40 минут идет на скорости 0.33.. ну, если это 5-микронник на силикагельной основе, то наверное, можно скорость и поднять раза в два-три. Тогда анализ будет идти минут 10-15, и никаких кранов не надо))) просто реально разделение там будет в самом-самом начале хроматограммы (так и есть в тех работах по этой теме), а потом будут пики всяких остаточных белков в пробе. Я просто подумал - можно после нужного разделения просто направить поток обратно, но я погорячился - это экономически необоснованно)) дорого, да и схему прибора усложняет.
Я бы заказал 400 сек 750мм, предварительно запросив на нее калибровочную кривую. Но в любом случае придется калибровать самому по полисахарам.

[Николай]

Костя спасибо!!! Буду заказывать, буду пробовать.))

[Иван Стыскин]

Кран нужен 6 портовый двуходовой. Такой используется на методике на дизтопливо.
Касательно колонки, стандартные размеры SEC теперь 8х300 мм. При расходе 1.5
давление под 170 атм. Так что едва ли расход можно будет поднять до 3 мл/мин.
Хотя с термостатом...

[Николай]

Здравствуйте Константин!

Чтоб не плодить темы, спрошу еще одного совета здесь.
Есть некий продукт представляющий из себя смесь чего-то молочного,злаков там всяких, наверно крахмала, клетчатки и еще бог знает чего там намешано. Предполагается наличие в продукте уксусной кислоты. Я основные крупные компоненты вроде убрал, попробовал посмотреть на репросиле С18 AQ элюент 0,5% фосфорки, пик кислоты выходит на 3 минуте если чистый брать р-р, с продуктом же получается косяк, вначале выходит пик дикой ширины и высоты который перекрывает искомый пик. Возможно ли как нибудь увеличить время удерживания уксусной к-ты?

Спасибо!

P.S. Для осаждения использовались р-ры цинка сернокислого и гексацианоферрата калия может в них собака порылась?

[Константин Сычев]

Николай, добрый день!

Ну, из самого примитивного - можно засолить элюент, например, от 15 до 50 мМ фосфата устроить (с кислотой конечно же) - может, расползутся.
Дальше - сложнее - это ТБА, т.е. перейти в ион-парный режим. рН там придется держать слабокислый или близко к нейтральному, возможно уширение пика при каком-то рН. В этом случае в элюенте может понадобиться даже небольшая доля ацетонитрила, но очень небольшая. Мнус - колонку от ТБА потом лучше отмыть.
Ну, если есть анионообменная колонка силикагельная - можно на ней. Ацн-вода, видимо, просто.

[Николай]

Константин, спасибо!

Вчера как раз пробовал 25мМ фосфата картинка поинтересней стала, анионообменной к сожалению нет.

[Константин Сычев]

можно солить хоть до 100мМ, но поток лучше не останавливать тогда - а в конце дня всю систему надо промывать водой, а потом заполнять ацетонитрилом на ночь

[OLGA]

Здравствуйте Константин!

Пожалуйста помогите в решении вопроса о пробоподготовке мочи (крысы Вистар) для проведения УЭЖХ-МС-МС с целью идентификации метаболитов фармацевтического препарата. Есть методика по определению этих продуктов в плазме, там предлагается проводить термоденатурацию белков в водяной бане при +70 , подкислить раствором FA и провести ферментативную деконьюгацию проб. Вопрос: необходимо ли проводить это для мочи и вообще где можно посмотреть методы пробоподготовки мочи для этого анализа.
Спасибо

[Константин Сычев]

Добрый день, Ольга! Ну, раз написано... А в чем именно видится проблема? Да, есть такой способ избавиться от остаточных белков плазмы - ферментативно их развалить на неудерживаемые олигопептиды. Если работает - то и отлично. У нас несколько другой подход, мы продаем сразу анализаторы с двумеркой, т.е. на первой ступени идет гель-фильтрация, фракция с целевыми (уже без белков) идет на концентрирующий картридж, а дальше все поступает уже на аналитическую колонку. Тоже способ. В нем можно колоть плазму сразу после осаждения белков FA.