Воспроизводимость в ВЭЖХ

[A-nete]

Здравствуйте!Я на форуме новичок!!!
У меня вопрос....
Я работаю на жидкостном хроматографе фирмы SHIMADZU,выполняю анализ по определению бенз(а)пирена.При заколе серии стандартных образцов одинаковой концентрации нет воспроизводимости пиков(все пики разной высоты),при этом время выхода стандартов неизменно.Поток подвижной фазы стабилен,видимых утечек нет,рабочее давление в норме.В чем может быть причина разной высоты пиков???Спасибо.

[Константин Сычев]

Добрый день!

Давайте так - я дождусь Вашего ответа, а затем перенесу эту тему в раздел "вопросы по ВЭЖХ", хорошо? это чтобы Вы потом нашли ответ..

Итак... наверное, тут два вопроса:

1. высота не вспроизводится, или площадь не воспроизводится? если воспроизводится площадь, то все нормально. высота вполне может не воспроизводиться, это, в принципе, нежелательно, но не критично.
2. инжектор ручной, или самплер? если ручной, то вводите полную петлю?

[A-nete]

Здравствуйте, Константин! у нас автосамплер, да площадь пиков изменяется. Например, стандарт с концентрацией 0,005 мкг/мл при пятикратном заколе показывает вот такие площади:41986,35429,28445,28504 и 36659.

[Константин Сычев]

Так или иначе - дело в системе инжектирования. Неисправен автосамплер - это только одна возможная причина. Могут быть разные интересные случаи. Например, промывочная жидкость действует неэффективно. Например, вещество обладает хелатирующими свойствами, а промывка на шимадзу - 80% изопропанола 20% воды - совершенно не может смыть его с иглы. Т.е. для начала можно поиграть с промывочной жидкостью, промывать кислой водой, например. Либо - что правильнее - ПРОВЕСТИ ПОВЕРКУ ПРИБОРА - методика ведь рядышком. Поколоть раствор антрацена как сказано в методике. И только с такими результатами можно обращаться в сервис-службу поставщика.

[A-nete]

Спасибо, Константин, будем пробовать.

[ksekuraeva]

Добрый день!
Наша проблема вот в чем: мы производим анализ препарата содержащего аскорбиновую кислоту, но начиная с 25 числа мы не можем добиться сходимых результатов. Площадь пика все время падает. У остальных компонентов со сходимостью все в порядке. Было подозрение что это от жары, но при комнатной температуре 25 градусов ничего не изменилось, площадь по-прежнему падает.

[Константин Сычев]

Ну это совершенно нормально, она разваливается. Дело ведь не в температуре, а в окислении. А там большой разницы нет между 30 и 25 градусами. Во-первых, надо что-то антиокислительное добавлять, а лучше воду тщательно дегазировать, а лучше и то и другое - особено если в образце есть например металлы. Есть еще автосамплеры с охлаждением до 10 например градусов - но это уже так, больше для очистки совести.

[AlterMax]

Доброе утро!
А у нас вот тоже маленькая проблема, связанная с консервантами. Хроматограф Шимадзу. Я сам новичок. При проверке концентраций в калибровочных растворах сорбиновой и бензойной кислот она (концентрация) почему-то со временем медленно растет. Например, был приготовлен раствор бензойной кислоты массовой концентрации 1 мг/дм3. Со временем пик становился чуть выше, площадь тоже возрастала и концентрация становилась выше (1,1; 1,18; 1,2; 1,29 мг/дм3). Срок хранения растворов бензойной кислоты - 6 месяцев, сорбиновой - 2. С чем это связано?
И еще - при заколе калибровочного раствора бензойной кислоты, со временем начал вылезать маленький пик, скорее даже следы сорбиновой кислоты. Раз через раз. Но откуда она там взялась, если был приготовлен чистый раствор бензойки? Аналогичная ситуация и с сорбиновой, иногда видны следы бензойной кислоты. Причем вначале этого не было, появились спустя пару месяцев использования хроматографа.

[Константин Сычев]

Привет, Алекс!
Самое простое - это плоховатая промывка инжектора. Видимо, у Вас автосамплер.. попробуйте поколдовать с жидкостями промывки. Например, как первую ступень применять слабощелочную водичку, а может, даже подогретую. А вторую уже кисленькой водичной, как у подвижной фазы.
Ну и стандарты я бы почаще готовил.. все-таки полгода... как-то многовато

Если есть проблемы с разделением сорбинки и бензойки, ставьте амидкуС16 вместо С18.

[Иван Стыскин]

Да, сдается мне автосамплер. Промывка конечно хорошо, можно промыть и насосом если не получится через жидкости... Если есть ручной кран ввода пробы, попробуйте все проколоть на нем и посмотреть результаты. Если нет - советую докупить обычный Rheodyne 7725.

[ArtemD]

Здравствуйте!
Система Agilent 1100, на двух последовательно соединенных колонках GF-250 (size-exclusive) и с предколонкой производим препаративное разделение гидролизата белка. Буфер фосфатный, pH 7.3. Условия гидролиза каждый раз одни и те же, время выхода и количество пиков имеют одни и те же значения, но высота пиков веществ (и их площадь соответственно) почему-то падает с течением времени - так, месяц назад высота основного пика была 1200 mAU, две недели назад - 800 mAU, а сегодня - 400 mAU (и площадь в три раза меньше, чем у пика месяц назад). Провели тесты дейтериевой лампы - все тесты пройдены, кювета пропускает свет нормально, тест тоже успешно пройден.
Инжектор ручной и стоит петля на 100мкл, вводим постоянно немного большую пробу (~120мкл), так что и в объеме вводимой пробы ошибки быть не должно.
Недавно приготовили и прокололи стандарты белков - БСА, овальбумин и миоглобин, взвешивали те же количества, но высота пиков, при сравнении с аналогичным опытом месяц назад, упала в 2-3 раза.
В чем может быть причина? Спасибо за ответ!

[Константин Сычев]

В ЛАМПЕ! ))) какая разница, что тест проходит - т.е. она же зажигается) чему удивляться,, агилет - это 100% китай, включая грошовые лампы. советую купить для прибора хорошую некитайскую лампу типа герауса или другой нормальной фирмы. думаю, когда на форум зайдет Иван Стыскин, он напишет есть ли у нас на складе замены ламп на 1100. ну или просто позвоните на общий элсико +7 (495) 210-1888 и задайте вопрос про лампу на 1100-ый

[Иван Стыскин]

Трудно делать диагноз, но насчет лампы не был бы так однозначен, как Константин. Тесты и правда бывает проходят и дохнущие лампы. А бывает и новые не проходят, недавно такая ситуация была у заказчика на Agilent 1290 DAD. Мне кажется возможная проблема в узле ввода пробы... Самое слабое место в Аджиленте, если автосаплер. Но раз ручной ввод - смотреть течи при вводе пробы. Уплотняется ли нормально шприц в игольном порту и тд. Я бы и буфер заново приготовил.
Раз речь о 1100-ой системе ей минимум 9 лет. Теперь подробнее про детектор. У Вас модель UV (VWD) или DAD?

[ArtemD]

У нас -multiple wavelength detector.
Огромное спасибо за ответы! Думал, что если лампа проходит тесты, то значит все нормально, а оно вон как бывает.
Извините, что побеспокоил в сущности, как оказалось, по пустячному вопросу. Выяснилось, что в буферный раствор каждый раз добавлялось разное количество азида натрия (консерванта и хромофора): вообще без него, 0,005% и 0,01%.

[Константин Сычев]

Так, хорошо... но почему же площать пиков-то уменьшалась? т.е. гипотеза, что в растворе азида рН щелочной, поэтому и поглощение белка уменьшается? я бы проверил это на простейшем спектрофотометре, на двух растворах белка с разным рН (или концентрацией азида).

[ArtemD]

Буфер 0,2М дигидрофосфат калия, он имеет хорошую буферную емкость в pH 7 и азид в такой концентрации тут погоды не делает, я проверял.
А чем вы отмываете систему? После работы с буфером мы промываем систему водой с азидом. Но, заметил, когда включаем после этого через пару дней хроматограф, то на длине волны 210 базовая линия неустойчива (либо "сыпится", либо ползет куда-то вверх), приходится отмывать изопропанолом непосредственно перед анализом...

[Константин Сычев]

Артем, Вы сами таким образом сказали, что азид не имеет никакого отношения к проблеме изменения площади. Чудес не бывает - это по-прежнему либо течь инжектора, либо смерть лампы.
От буфера обращенку отмывают водой, разумеется) без азида. Ведь у него щелочной рН, а силикагель растворяется в щелочи. Вы так просто колонку быстро угробите - щелочь нельзя!

[ArtemD]

Проколол без азида - высота и площадь пиков увеличились до первоначального (когда кололи без азида) значения. А как вообще высота пика может уменьшиться или увеличиться без изменения его площади, если он, конечно, при таком изменении высоты не расширится или не сузится?
Систему промываем водой с азидом в обход колонки, и, кроме того, азид в такой концентрации (0, 01%) особо не защелачивает - наш немного кислый бидистилят поднялся с pH 6.4 до 7.3, я это промерял.
Да и вот тут http://www.prochrom.ru/ru/?idp=BioSep , например, похожего типа колонки рекомендуют хранить: "Для длительного хранения используйте 0.05% раствор NaN3 в воде или 10% раствор метанола в воде."

[Константин Сычев]

Ну, дело значит в зависимости УФ спектра белка от рН; в принципе, это вполне возможно. Равное увеличение высоты и площади означает, что пик остался прежней формы, т.е. дело не в хроматографии как таковой.
При рН более 7 использовать, а тем более хранить силикагель нельзя - он просто растворяться будет. Лучший вид консевции - чисты органический растворитель. Самый дешевый - изопропанол. Но из-за приличной вязкости, если колонка оставляется не очень надолго, можно и чистым ацетонитрилом заполнять. И поменьше читайте сайт аквилона - не одно поколение, помнится, угробило свои с18 колонки, "регенерируя" их гексаном (у них висел такой рецепт, теперь вроде сняли)))

[AlterMax]

А как долго может хранится ацетат аммония (ph 4.3) в укупоренной таре? (я использую его для определения консервантов в молочке в соотношении с ацетонитрилом 65:35, прибор Шимадзу, градиентный режим, фильтр опущен в бутыль емкостью 2 литра (solvent A) ) Как часто его нужно менять? И нужно ли в конце рабочего дня перемещать фильтр из емкости с ацетатом аммония в емкость с дистиллированной водой для промывки поточной линии? И вообще на что влияет ацетат аммония ?

[Константин Сычев]

Как правило, предпочитают не хранить буферы больше нескольких дней. Хранят в холодильнике.
Если соли немного, то промывать в конце дня водичкой или 10%-ной водной органикой можно только насос.

Условия определения ужасные. А что за конкретно за консерванты? Судя по играм с рН, пытались разделить сорбиновую и бензойную на С18 колонке, но градиент указывает, что в смеси есть что-то еще.
Если Вы в Москве, можете занести стандарты и свои объекты к нам. Анализ мне интересен, чтобы сделать хорошую методику - анализ, видимо, довольно ходкий.
Вот можете посмотреть viewtopic.php?f=29&t=180

[AlterMax]

Консерванты - сорбиновая и бензойная кислоты.
По методике - http://vsegost.com/Catalog/49/49834.shtml

[Константин Сычев]

Ужасная методика) придумавшие ее недостойны называться хроматографистами)) все, что можно сделать неправильно - они сделали))
Хорошо, разработаю условия под этот анализ. Только надо пропионовую кислоту раздобыть...

[AlterMax]

Спасибо) но пропионку мы не делаем все равно. А можно узнать в чем заключается ужасность методики? почему эта методика является гостом, если ее придумали неграмотные люди?

[ArtemD]

Спасибо большое Константину и Ивану за советы! Очень здорово, что специалисты помогают новичкам. Спасибо!

[Константин Сычев]

Артем, ужасность в почти неудерживаемости пропионки. Если ее не делать, то все более-менее. Но поскольку бензойка и сорбинка на с18 делятся плохо, нужны игры с рН, а обычно в ОФ режиме для лучшей воспроизводимости этого предпочитают не делать. Я бы разделил на амидкеС16 с подкислением до упора, рН 2-3.