Специальные ВЭЖХ колонки NanoSpher viewforum.php?f=54
Обучение ВЭЖХ, курсы по ВЭЖХ и разработке МВИ от авторов книги viewforum.php?f=15
Дополнительное обучение работе на ВЭЖХ оборудовании по необходимым Вам аналитическим методикам viewtopic.php?f=48&t=342
Разработка ВЭЖХ методик viewtopic.php?f=48&t=318
Многомерная техника ВЭЖХ эксперимента в настоящее время, по сути, только начинает развиваться – в отличие от подобной техники в газовой хроматографии, в которой многомерные (multidimensional) методы давно нашли свои приложения.
Идея многомерного (в самом простом случае – двумерного, 2D) метода состоит в последовательном разделении пробы на нескольких хроматографических колонках. В данной главе мы рассмотрим только двумерные методы.
В жидкостной хроматографии применение многомерного разделения может преследовать по крайней мере три цели:
- последовательное проведение высокоэффективной очистки пробы и хроматографического разделения;
- эмуляция градиентного элюирования при помощи многомерного изократического элюирования;
- многократное увеличение разрешающей способности (пиковой плотности) хроматографического разделения за счет его многомерности.
Чтобы избежать путаницы в терминологии, все хроматографические системы подобного рода будем называть ВЭЖХ системами с переключением колонок. Многомерной (двумерной) ВЭЖХ будем называть только системы последнего типа, т.е. целью которых является многократное увеличение пиковой плотности хроматограммы за счет ее многомерности. Рассмотрим каждый из типов систем с переключением колонок более подробно.
Эмуляция градиентного элюирования при помощи многомерного изократического элюирования. Это наиболее экзотический и не очень часто применяемый многомерный метод, рассмотрение которого, тем не менее, позволит наиболее быстро освоить логику конструирования систем с переключением колонок.
Схема наиболее общей системы такого типа приведена на рисунке 1. После системы инжектирования устанавливают переключающий кран, на котором монтируют две хроматографические колонки. Обе колонки работают в одном режиме и на одном элюенте. Детектора два: первый на выходе первой колонки, второй – на выходе второй колонки.
Рисунок 1. Схема-эмулятор1
После поворота крана инжектора проба попадает на первую колонку. Слабо удерживаемые соединения проскакивают на вторую колонку, после чего поворачивают переключающий кран. Удовлетворительно удерживаемые соединения разделяются на первой колонке и определяются первым детектором. В это же время соединения, проскочившие на вторую колонку, за счет большего на ней удерживания также разделяются, а затем определяются вторым детектором.
Для того, чтобы подобная система работала по описанной схеме, необходимо правильно подобрать тип и типоразмер обеих колонок. Здесь возможны два варианта. Первый вариант: обе колонки заполнены одним и тем же адсорбентом. В этом случае первая колонка должна быть значительно короче второй (например, 50 мм и 250 мм). Второй вариант: применяют колонки одинакового типоразмера (соответственно, одинаковой длины). В этом случае адсорбент второй колонки должен опеспечивать большее удерживание. В обращенно-фазовом режиме на место первой колонки можно установить С18 фазу с меньшей долей углерода (наример, 12%), а на место второй – С18 фазу с большей долей углерода (например, 17%).
Данную схему можно упростить, оставив только один детектор (см. рис. 2). Плата за упрощение системы – необходимость с филигранной точностью синхронизировать времена элюирования компонентов с первой и второй колонки, чтобы они могли определяться одним детектором.
Рисунок 2.Схема-эмулятор2
Система работает следующим образом. После поворота крана инжектора проба попадает на первую колонку. Слабо удерживаемые соединения проскакивают на вторую колонку, после чего поворачивают переключающий кран. Удовлетворительно удерживаемые соединения продолжают разделяться на первой колонке, в то время как проскочившие соединения разделяются на второй. После разделения на второй колонке разделенные компоненты попадают обратно в первую колонку, где они практически не удерживаются и начинают догонять компоненты, разделяемые первой колонкой. При верной синхронизации все компоненты могут быть определены одним детектором.
Схема может показаться слишком вычурной для аналитической хроматографии, но она показывает хорошие результаты при препаративных разделениях, например, при высокоэффективной очистке дорогих фармацевтических субстанций.
Следует отметить, что описанные системы с переключением колонок можно назвать многомерными лишь условно, поскольку разделение на обеих колонках происходит в одном и том же хроматографическом режиме, т.е. формально в одном измерении.
ВЭЖХ системы для последовательного проведения высокоэффективной очистки пробы и хроматографического разделения. Наиболее простой системой такого рода является ВЭЖХ с он-лайн твердофазной экстракцей, он-лайн ТФЭ. После системы инжектирования устанавливают переключающий кран, на котором монтируют адсорбционный картридж (или очень короткую колонку, например, предколонку длиной 10-20 мм), а также (в другую позицию крана) основную хроматографическую колонку. Инжектор соединяют с насосом, подающим промывочную жидкость для картриджа. Позицию крана, в которую установлена хроматографическая колонка, соединяют со вторым насосом, который подает элюент.
После поворота крана инжектора проба в потоке промывочной жидкости попадает на ТФЭ картридж; целевые соединения удерживаются на картридже, а сопутствующие соединения вымываются из него промывочной жидкостью. Через некторое время поворачивают переключающий кран. В картридж поступает элюент. Целевые вещества, смытые с картриджа, в потоке элюента попадают в хроматографическую колонку (см.рис. 3).
Рисунок 3. Схема с ТФЭ
Такая система позволяет провести предварительную очистку пробы перед ее инжектированием на основную хроматографическую колонку. Прежде всего, ее применяют для удаления из пробы высокомолекулярных компонентов матрицы, мешающих определению (например, белков). В этом случае картридж заполняют т.н. ОДП материалами, материалами с ограниченно доступной поверхностью (RAM, restricted access material). Эти адсорбенты обеспечивают разделение в смешанном адсорбционном/эксклюзионном режиме, удерживая целевые соединения по адсорбционному механизму и удаляя высокомолекулярные соединения по эксклюзионному механизму.
Традиционно системы с он-лайн ТФЭ применяют в обращенно-фазовом режиме, но их можно вполне успешно применять практически во всех адсорбционных режимах.
Ключевая схема одновременной высокоэффективной очистки и хроматографического определения называется хроматографической лупой (heart cutting). После системы инжектирования устанавливают первую (высокоэффективную) колонку – именно на ней происходит высокоэффективное фракционирование пробы. Выход первой колонки соединяют с переключающим краном. На переключающий кран монтируют вторую хроматографическую колонку, а в другую позицию крана – петлю определенного объема или концентрирующий картридж. Адсорбционный материал картриджа по своей химии должен соответствовать материалу второй колонки. Инжектор соединяют с насосом, подающим элюент для первой колонки. Переключающий кран соединяют с насосом, подающим элюент для первой колонки (см. рис. 4).
Рисунок 4. Схема "хроматографической лупы"
После поворота крана инжектора проба разделяется на первой колонке. В момент начала элюирования фракции целевых веществ поворачивают переключающий кран. Если на кране установлен ТФЭ картридж, то в момент конца элюирования фракции целевых веществ переключающий кран поворачивают обратно. Если на кране установлена петля, то переключающий кран поворачивают обратно в момент заполнения петли; объем петли следует подобрать так, чтобы в нее вмещался бы весь объем фракции целевых веществ.
Таким образом, на вторую колонку попадает только достаточно узкая фракция пробы, которая содержит целевые вещества.
Схема хроматографической лупы отличается от схемы с он-лайн ТФЭ (и тем более от схем-эмуляторов градиентного разделения) одной ключевой особенностью: эту схему бессмысленно применять, имея две колонки с одинаковой селективностью. При равной селективности смысл в применении двух колонок потеряется – для разделения будет достаточно одной колонки, наиболее эффективной из двух.
Таким образом, именно на схеме хроматографической лупы становится понятен смысл многомерности разделения: под измерением здесь подразумевается не колонка как таковая, а та или иная уникальная селективность разделения. В пределе, наибольшей эффективности приведенная схема достигает в условиях работы в двух различных хроматографических режимах.
Чисто технические сложности, к сожалению, позволяют сопрягать в одной системе не любые пары хроматографических режимов (десять пар) в любых последовательностях (двадцать вариантов), а только некоторые из них. Эти сложности можно преодолеть, только усложнив конструктивную схему системы. Технические ограничения таковы:
- первый и второй элюенты должны быть взаимно растворимы;
- первый элюент должен обладать низкой элюирующей силой для второй хроматографической колонки.
В первом приближении, можно назвать пять вариантов сочетания режимов для водных элюентов (первым приводится режим работы первой колонки):
- эксклюзионный (водн.), обращенно-фазовый;
- эксклюзионный (водн.), ионный;
- ионный, обращенно-фазовый;
- обращенно-фазовый, ионный;
- гидрофильная хроматография, ионный.
Подобным образом, можно назвать всего два варианта для элюентов на основе гексана:
- с переносом заряда, нормально-фазовый;
- нормально-фазовый, с переносом заряда.
Приведенные сочетания режимов, как правило, возможно реализовать с помощью схемы хроматографической лупы напрямую, без необходимости применения каких-либо вспомогательных технических решений.
К сожалению, без них нельзя обойтись при сопряжении обращенно-фазового режима и гидрофильной хроматографии. В этом случае на переключающем кране обязательно должен быть установлен картридж – причем со специально подобранным адсорбентом, гидрофобность которого значительно выше таковой для обращенно-фазового адсорбента первой колонки. Например, в качестве первой колонки можно установить С18 фазу с пониженной долей углерода (8-12%), а картридж заполнить нейтральным полистирол-дивинилбензолом высокой сшивки.
ВЭЖХ системы для многократного увеличения разрешающей способности (пиковой плотности) хроматографического разделения за счет его многомерности. По сути, именно такие системы можно с полным правом назвать многомерными.
В двумерных систмах узкие фракции элюата с первой колонки непрерывно, друг за другом, поступают на вторую колонку. Вторая колонка, как правило, является короткой, т.е. обеспечивает быстрое разделение "во втором измерении" за то время, которое необходимо для отбора очередной фракции с первой колонки.
Если время хроматографического разделения на второй колонке превышает время отбора очередной фракции, то вторых колонок (одинаковых) необходимо несколько штук. Прибор должен автоматически:
- перераспределять фракции на свободные откондиционированные колонки,
- кондиционировать колонки, отработавшие цикл,
- получать данные с колонок, на которых происходит разделение и т.д.
Подобная ВЭЖХ система, соответственно, должна управляться специализированным программным обеспечением. Кроме того, ПО для обработки данных также должно быть специализированным, и позволять работать с двумерными пиками (при многоканальном детектировании – трехмерными). Таким образом, систему двумерной ВЭЖХ нельзя просто собрать из различных стандартных блоков, как любую иную систему с переключением колонок. Это отдельный инструмент, который выспускают компании-производители аналитического оборудования.
Все хроматографические особенности сочетания режимов, присущих схеме хроматографической лупы, в полной мере справедливы и для двумерной хроматографии. Режимы "ионный + обращенно-фазовый" и "эксклюзионный + обращенно-фазовый", к примеру, применяют в протеомных исследованиях. В первом случае ионная колонка может быть капиллярной – удобно и с позиции малого потребления пробы (в протеомике это важно), и с позиции малого объема фракции, наносимой на вторую колонку. Вместо того, чтобы применять ВЭЖХ разделение на первой колонке, хроматограф вообще можно состыковать с системой капиллярного электрофореза. Режимы "нормально-фазовый + с переносом заряда" и "обращенно-фазовый + с переносом заряда" (при неоходимости можно осуществить и это сочетание) применяют для разделения сложных смесей триглицеридов, иных липидов, углеводородов.
В любом случае, двумерная хроматография – это метод решения достаточно сложных исследовательских задач. Для рутинных анализов предназначены системы с он-лайн ТФЭ и системы хроматографической лупы.