Анализ полифенольных соединений кофе и чая в режиме гидрофильной ВЭЖХ
Журнал "Аналитика", №4, 2012. В печати
Для разделения спектра кофеилхинных кислот кофе и катехинов чая был применен гидрофильный (HILIC) режим жидкостной хроматографии. Основная цель исследования заключалась в том, чтобы установить последовательность элюирования целевых соединений в условиях гидрофильной хроматографии. В ходе исследования авторам удалось подобрать подходящие условия разделения и показать, что разработанные подходы могут быть положены в основу соответствующих аналитических методик.
Ключевые слова: гидрофильная ВЭЖХ, HILIC, природные соединения, гидроксикоричные кислоты, катехины
1. Введение
Термином «гидрофильная хроматография» мы будем обозначать хроматографический режим, по свойствам формально соответствующий нормально-фазовой ЖХ, в котором, однако, в качестве подвижных фаз применяют полярные водно-органические смеси. В международной литературе этот режим обозначают аббревиатурой HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography, хроматография за счет гидрофильного взаимодействия). Оборот «… за счет гидрофильного взаимодействия», скорее всего, отражает специфику профессии автора термина, Andrew J. Alpert, который занимался хроматографическим разделением и очисткой биологических полимеров.
Термин «HILIC» был введен им в обращение в 1990 году [1]; однако, сам метод достаточно широко применялся в практике и ранее, без специального названия или под другими названиями.
Например, в России режим гидрофильной хроматографии активно продвигался Леонидом В. Сапрыкиным под названием «ДИРФ» (динамически-индуцированный раздел фаз); специфика такого названия объясняется тем, что автор часто работал в режиме динамического модифицирования, варьируя селективность силикагеля (и попутно борясь с его низким качеством). В 1990 и 1992 годах в «Заводской лаборатории» были опубликованы одни из первых отечественных статей, в которых описывались аналитические подходы с применением режима гидрофильной хроматографии [2,3].
Популярность HILIC режиму принесло сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектроскопическим детектированием плюс аналитические задачи из области протеомики и фармацевтики. Многие полипептиды и фармацевтические субстанции обладают высокой полярностью; для их разделения в обращенно-фазовом режиме подвижная фаза должна большей частью состоять из воды, что не всегда удобно с точки зрения МС детектирования. Гидрофильный режим, в котором подвижная фаза обогащена органическим растворителем, выглядел весьма перспективным методом хроматографического разделения. По этой причине его «достали с пыльной полки» и начали применять вновь. Мода на HILIC началась в начале 2000-х, а бум публикаций по гидрофильной хроматографии пришелся на 2004 год [4].
В процессе применения HILIC выяснилось, что гидрофильная хроматография полезна и как самостоятельный метод, то есть без оглядки на его применение исключительно в сочетании с ВЭЖХ-МС инструментальным оформлением. Рассеялись также многие мифы прошлого, связанные с HILIC, к примеру, о принципиально низкой эффективности разделения, или о принципиально низкой гидролитической устойчивости силкагеля в условиях гидрофильной хроматографии.
Тем не менее, закономерности данного режима до сих пор остаются исследованными очень плохо. Сейчас даже специалист, например, не сможет внятно ответить на вопрос о том, какие вещества удерживаются в гидрофильной хроматогрфии лучше, а какие хуже. В такой ситуации важными задачами являются накопление и систематизация хроматографических данных по удерживанию в HILIC сосединений различных химических классов.
В этой работе мы хотели ли бы акцентировать внимание на изучении поведения в гидрофильном режиме двух классов полифенольных соединений: полярных гидроксикоричных кислот (на примере кофеилхинных кислот) и катехинов.
2. Разделение гидроксикоричных кислот кофе
Кофеилхинные кислоты, как следует из названия, являются сложными эфирами, которые состоят из двух структурных единиц: хинной кислоты и кофейной кислоты – где хинная кислота выступает в роли многоядерного спирта. В водном экстракте кофе содержатся как моно-, так и дикофеилхинные кислоты, то есть с одним или с двумя остатками кофейной кислоты, присоединенными к хинной кислоте сложноэфирной связью.
Наиболее широко известным представителем кофеилхинных кислот является 3-кофеилхинная, или хлорогеновая, кислота (рис. 1). У хлорогеновой кислоты есть два изомера: 4-кофеилхинная и 5-кофеилхинная кислоты. В экстрактах кофе содержатся все три изомера.
Рисунок 1. Хлорогеновая (3-кофеилхинная) кислота
Традиционным методом разделения является обращенно-фазовая хроматография на С18 силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке «3-, кофеин, 5-, 4-»; дикофеилхинные кислоты элюируются после монокофеилхинных (рис. 2).
Рисунок 2. Хроматограмма водного экстракта кофе. НФ: 100х3 Reprosil-Pur ODS-3 (3 мкм). ПФ: 10% ацетонитрила в 0.5%-ном водном растворе фосфорной кислоты. Скорость потока 1 мл/мин. Температура 25 °С. Детектирование: УФ 270 нм, 330 нм. Источник: http://www.chromforum.ru
Как вариант, применяют также ОФ разделение на С16-амидных силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке «3-, кофеин, 4-, 5-»; дикофеилхинные кислоты также элюируются после монокофеилхинных (рис. 3). По сравнению с «С18» вариантом разделения, «С16-амидное» характеризуется в целом более сильным удерживанием и лучшим разделением хлорогеновых кислот друг от друга и от сопутствующих минорных гидрокикоричных кислот. Более сильное удерживание наблюдается и для дикофеилхинных кислот, что является уже, скорее, минусом, поскольку сильно увеличивает общую продолжительность анализа.
Рисунок 3. Хроматограмма водного экстракта кофе. НФ: 250х4.6 Reprosil Amid C16 (5 мкм). ПФ: 12% ацетонитрила в 15мМ фосфатном буферном растворе с рН 2.5 (фосфорной кислотой). Скорость потока 2 мл/мин. Температура 25 °С. Детектирование: УФ 270 нм, 330 нм. Источник: http://www.chromforum.ru
Более сильное удерживание и иную селективность разделения гидроксикоричных кислот на С16-амидных фазах можно объяснить, исходя из предположения о наблюдаемом смешанном ОФ/НФ (обращенно-фазовом/нормально-фазовом) режиме. Определенный вклад нормально-фазового режима в этом случае обусловлен наличием амидных групп в структуре адсорбента и наличием протон-донорных и протон-акцепторных (прежде всего, гидроксильных алифатических и фенольных) функциональных групп в составе целевых соединений.
Исходя из этого предположения, в режиме гидрофильной хроматографии мы ожидали, что монокофеилхинные кислоты будут элюироваться после кофеина. Порядок элюирования изомеров предсказать не пытались, поскольку эксперимент проводили не на специальных амидных фазах для HILIC, а на традиционных силикагеле и силикагельной аминофазе.
Наиболее же интригующим был вопрос о порядке элюирования дикофеихинных кислот: они либо должны были элюироваться полностью после, либо полностью до монокофеилхинных. В пользу первого свидетельствовало большее количество гидроксильных групп в дикофеилхинных кислотах (плюс две фенольные при минусе в одну алифатическую), в пользу второго – значительно больший размер их молекулы (существует тенденция, согласно которой в гидрофильном режиме при условии равного количества полярных функциональных групп сильнее удерживаются меньшие по размеру молекулы).
На практике оказалось, что реализуется второй вариант: и на силикагеле, и на аминофазе в условиях гидрофильной хроматографии все дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Предположение об элюирования монокофеилхинных кислот после кофеина оправдалось для аминофазы, но не для силикагеля (рис. 4). Порядок элюирования изомеров хлорогеновой кислоты и кофеина для аминофазы: «кофеин, 5-, 4-, 3-»; для силикагеля его установить не удалось из-за отсутствия разделения.
Рисунок 4. Хроматограмма водного экстракта кофе. НФ: 150х4.6 Reprosil-Pur NH2 (3 мкм). ПФ: 5% подкисленной (с 0.5% фосфорной кислоты) воды в ацетонитриле. Детектирование: УФ 270 нм, 330 нм. Вверху: скорость потока 3 мл/мин; температура 60 °С. Внизу: скорость потока 1.5 мл/мин; температура 25 °С. Источник: http://www.chromforum.ru
Оптимальный состав подвижной фазы для аминофазы – несколько процентов подкисленной воды в ацетонитриле. Пяти процентов достаточно для приемлего разделения при минимальной продолжительности анализа; для оптимизации разделения за счет увеличения удерживания содержание воды в подвижной фазе можно уменьшить до 2-3%.
Увеличение температуры с 25 °С до 60 °С не приводит к существенному изменению удерживания целевых соединений в целом, лишь несколько изменяя селективность их разделения.
Перепад давления при работе на 150х4.6 колонке с 3-х мкм фазой на скорости 1.5 мл/мин составляет менее 100 атм (25 °С). «Дружественная» гидродинамика хроматографической системы позволяет сократить время анализа путем увеличения скорости потока до 3-4 мл/мин, либо существенно улучшить разделение за счет увеличения эффективности путем наращивания длины колонки до 250-300 мм (например, применяя две 150х4.6 колонки с 3-х мкм фазой, соединенных последовательно).
Разделение в гидрофильном режиме имеет определенное преимущество перед разделением в ОФ условиях. Поскольку дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных, после пика хлорогеновой кислоты хроматограмма однозначно может быть остановлена – дальше на длинах волн 270/330 нм на хроматограмме нет ни одного пика существенной интенсивности. Таким образом, все разделение ограничено фактором удерживания всего k’ = 3 (в выбранных условиях элюирования). К сравнению, при изократическом элюировании в обращенно-фазовом режиме (на С18 фазах) из условия хорошего разделения хлорогеновых кислот автоматически следует высокие значения удерживания дикофеилхинных кислот вплоть до k’ = 40 (!).
Соответственно, разделение в гидрофильном режиме больше подходит для применения в рутинных аналитических методиках, чем разделение в ОФ режиме, поскольку при изократическом элюировании за ограниченное k’ = 3 полностью решает две основные аналитические задачи:
- количественный анализ изомеров монокофеилхинных кислот (на длине волны 330 нм);
- количественный анализ кофеина (на длине волны 270 нм).
Разделения же в ОФ режиме на С18 или С16-амидных фазах больше подходят для исследовательских целей, поскольку позволяют достичь в целом больших величин разрешения пиков целевых соединений. Наиболее информативным, на наш взляд, было бы разделение на С16-амидной фазе в условиях градиентного элюирования при правильно оптимизированном профиле градиента «вогнутой» формы.
И еще небольшой комментарий, касающийся условий детектирования. Кофеин практически не поглощает на длине волны 330 нм; совпадения пиков кофеина на 270 нм и некоторых пиков на длине волны 330 нм на верхнем и нижнем рисунках 4 случайны. Соответственно, кофеин не может помешать детектированию гидроксикоричных кислот, но обратное не верно: гидроксикоричные кислоты поглощают на длине волны 270 нм, и их наложение их пиков на пик кофеина может привести к завышенным результатам определения кофеина.
Подобное наложение не критично для разделения в гидрофильном режиме, поскольку на пик кофеина накладываются минорные пики дикофеилхинных кислот. Тем не менее, для аналитических целей специфичность детектирования кофеина можно повысить, установив вместо 270 нм длину волны в диапазоне 290-300 нм. В спектрах гидроксикоричных кислот в этом диапазоне наблюдается «провал», а кофеин все еще обладает существенным поглощением.
3. Разделение катехинов зеленого чая
Катехины являются основными полифенольными компонентами зеленого и белого чаев. Как правило, в спиртовых экстрактах зеленого чая определяют четыре катехина: эпигаллокатехин, эпикатехин, галлат эпигаллокатехина (рис. 5) и галлат эпикатехина.
Рисунок 5. Галлат эпигаллокатехина
Традиционным методом анализа является обращенно-фазовая хроматография (рис. 6). В принципе, ОФ разделение катехинов лишено каких-либо существенных недостатков. Небольшой минус селективности обращенно-фазовой системы состоит в том, что последний пик эпикатехингаллата имеет довольно высокое удерживание (расположен немного «на отшибе») и за счет этого увеличивает общее время хроматографирования. Попытка экстенсивными способами (т.е. не меняя селективность) уменьшить время анализа приводит к ухудшению разделения критической пары эпикатехин/эпигаллокатехингаллат. Таким образом, разумный ресурс удерживания для разделения катехинов в ОФ режиме составляет порядка k’ = 7.
Рисунок 6. Хроматограмма спиртового экстракта зеленого чая. НФ: 250х4.6 Reprosil-Pur Basic C18 (5 мкм). ПФ: 17% ацетонитрила в 0.5%-ном водном растворе фосфорной кислоты. Скорость потока 2 мл/мин. Температура 25 °С. Детектирование: УФ 205 нм, 270 нм. Источник: http://www.chromforum.ru
Интерес вызвало бы только такое альтернативное разделение, селективность которого обеспечивало бы сопоставимое разрешение при существенно меньших затратах k’. В принципе, полученное на аминофазе разделение катехинов в режиме гидрофильной хроматографии отвечает этому условию (рис. 7).
Рисунок 7. Хроматограмма ацетонитрильного экстракта зеленого чая. НФ: 150х4.6 Reprosil-Pur NH2 (3 мкм). ПФ: 5% подкисленной (с 0.5% фосфорной кислоты) воды в ацетонитриле. Скорость потока 1.5 мл/мин. Температура 60 °С. Детектирование: УФ 205 нм, 270 нм. Источник: http://www.chromforum.ru
В условиях гидрофильной хроматографии на аминофазе катехины элюируются после кофеина в порядке «эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина», который в целом соответствует увеличению полярности целевых соединений. Увеличение температуры с 25 °С до 60 °С, как и для оксикоричных кислот, не приводит к существенному изменению удерживания целевых соединений, однако, несколько улучшает селективность их разделения.
При использовании в качестве подвижной фазы 5%-ного раствра подкисленной воды в ацетонитриле разделение занимает всего k’ = 1.3. При этом перепад давления при работе на 150х4.6 колонке с 3-х мкм фазой на скорости 1.5 мл/мин составляет менее 50 атм (60 °С).
Разрешение на рис. 7, конечно, меньше, чем на ОФ хроматограмме на рис. 6, но простое масштабирование разделения 7 (например, с наращиванием длины колонки и скорости потока) показывает, что сопоставимого по величине разрешения в гидрофильном режиме можно добиться за время, по крайней мере в 2 раза меньшее, чем длительность анализа в обращенно-фазовом режиме. Соответственно, альтернативное разделение катехинов методом гидрофильной хроматографии не лишено некоторого преимущества.
4. Выводы
1. Оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения при использовании 3-х микронных адсорбентов достигается при длине колонки не менее 250-300 мм. Таким образом, при работе с 3-х микронными фазами в гидрофильной хроматографии целесообразно применять либо, в принципе, коммерчески доступные 250 мм колонки, либо связки по две 150 мм колонки. Для лучшего разделения можно конструировать и более длинные связки.
2. При разделении природных соединений в гидрофильном режиме наблюдается тенденция, согласно которой аминофаза показывает лучшие результаты, чем силикагель, и фазы с большей удельной площадью выигрывают у фаз с меньшей удельной поверхностью.
3. Повышение температуры не оказывает заметного влияния на удерживание природных соединений на аминофазе в гидрофильном режиме, лишь немного изменяя селективность. При этом при повышении температуры закономерно снижается вязкость подвижных фаз, в результате чего оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения, по всей видимости, смещается в пользу 150 мм колонок с 2 мкм адсорбентами. В этом случае вопросы уже вызывают гидролитическая стабильность таких упаковок при повышенных температурах и вообще технологическая возможность их производства.
4. На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Монокофеилхинные кислоты элюируются после кофеина; порядок их элюирования : «5-, 4-, 3-».
5. На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) катехины элюируются после кофеина в порядке «эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина».
5. Литература
[1] Alpert, Andrew J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. // Journal of Chromatography. 1990. V. 499. P. 177–196.
[2] Гусаров А.А., Сапрыкин Л.В., Киселева Н.В. Методика определения пантотената кальция методом ВЭЖХ с применением нетрадиционного режима хроматографии на силикагеле. // Заводская лаборатория. 1992. №11. С. 7-9.
[3] Сапрыкин Л.В., Киселева Н.В., Васильев В.Н. Хроматографический анализ витамина В6 и полупродуктов его синтеза. // Заводская лаборатория. 1990. Т. 56. №1. С. 49-54.
[4] Eric S. Grumbach. Silica Columns for the Retention of Polar Analytes and Enhanced ESI-MS Sensitivity. // LCGC NORTH AMERICA. 2004. V. 22. №10. http://www.chromatographyonline.com/lcg ... rticle.pdf